Имбирь от выпадения волос: Имбирь для волос — маски из масла и сока имбиря для роста и против выпадения волос

Волосяной фолликул млекопитающих содержит дермальный сосочек (DP), который в основном состоит из DP-клеток (DPC), и дермальную оболочку, происходящую из мезенхимы, а также эпителиальные клетки наружной корневой оболочки, внутренней корневой оболочки, матрицы и стержня волоса происходит из эпителия [11].Постнатальный волосяной фолликул проходит цикл анагена (фаза роста), катагена (фаза регресса) и телогена (фаза покоя). Взаимные взаимодействия между эпителием и мезенхимой важны для послеродового роста волос и цикличности волосяных фолликулов. DP, как известно, играет ключевую роль в регуляции роста волос и цикличности [11]. Таким образом, любой фактор, который влияет на функции DPC, может влиять на рост волос. Например, миноксидил [12] и эпигаллокатехин-3-галлат [4] стимулируют рост волос, оказывая свое антиапоптотическое действие на DPC (за счет увеличения соотношения Bcl-2 / Bax), это один из механизмов воздействия на Миноксидил.С другой стороны, цисплатин [13] приводит к выпадению волос, вызывая апоптотические эффекты на DPC (за счет уменьшения отношения Bcl-2 / Bax).

В последнее время было проведено несколько научных исследований, направленных на выделение и идентификацию активных компонентов имбиря, а также на научную проверку его фармакологического действия и действия его составляющих [14], [15]. Результаты показывают, что 6-гингерол является наиболее распространенным активным компонентом и обладает различными фармакологическими и микробиологическими эффектами, включая противоопухолевое, противовоспалительное, антиоксидантное и противорвотное действие; Однако фармакологические эффекты 6-гингерола на рост волос научно не доказаны.

В этом исследовании мы исследовали эффекты 6-гингерола на человеческие DPC и рост волосяного стержня ex vivo и рост волос у мышей.

Материалы и методы

2.1. Выделение и культивирование волосяных фолликулов человека

Образцы пункционной биопсии (4 мм) были взяты с неболедых затылочных костей головы пациентов, перенесших операцию по трансплантации волос по поводу андрогенной алопеции. Медицинский этический комитет Южного медицинского университета одобрил все исследования, описанные здесь.Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией принципов, и от всех пациентов было получено информированное письменное согласие. Волосяные фолликулы выделяли и культивировали, как описано Philpott et al [16]. Вкратце, волосяные фолликулы выделяли щипцами под бинокулярным световым микроскопом и культивировали в 24-луночных чашках в течение 7 дней в среде Williams E (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) с добавлением 10 нг / мл гидрокортизона, 10 мг / мл инсулина 2. мМ L-глутамин, 100 Ед / мл стрептомицина и 10 нг / мл гидрокортизона при 37 ° C в атмосфере 5% (об. / об.) CO ₂ .6-Гингерол (чистота> 95%; Sigma Chemical Co., Сент-Луис, Миссури) растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО; Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Пекин, Китай) и для сохранения конечной концентрации носителя < 0,1%. 6-Гингерол добавляли в культуральную среду в концентрации 10 или 20 мкг / мл, и 0,1% (об. / Об.) ДМСО использовали в качестве контроля. Во всех экспериментах культуральную среду и 6-гингерол обновляли через день. Всего 180 анагенных волосяных фолликулов от 3 разных добровольцев (60 фолликулов / субъект) культивировали при каждом условии роста.Средняя длина волосяного фолликула от дна дермальных сосочков в нулевой день составляла 4,5 мм.

2.2. Культура человеческих DPC

DPC выделяли и культивировали, как описано Magerl et al [17]. Вкратце, кожные сосочки были микродиссектированы с луковиц рассеченных волосяных фолликулов, перенесены на пластиковые чашки и культивированы в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM; Gibco, Grand Island, NY) с добавлением 100 Ед / мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицина и 20 мг / мл. % (об. / об.) фетальной бычьей сыворотки (FBS; Gibco) при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO ₂ .Эксплантаты выдерживали в среде в течение 7 дней, среду меняли каждые 3 дня. Когда рост клеток становился субконфлюэнтным, клетки собирали с 0,25% (мас. / Об.) Трипсин-ЭДТА (Invitrogen, Carlsbad, CA) и субкультивировали с соотношением деления 1: 3. После этого DPC поддерживали в DMEM с добавлением 10% FBS.

2.3 Анализы пролиферации клеток и апоптоза

Пролиферацию клеток определяли с помощью анализа МТТ, как описано Мосманном [18]. Вкратце, DPC (3 × 10 ⁴ клеток / лунку) высевали в 96-луночные планшеты и инкубировали в течение 24 часов перед добавлением 6-гингерола в концентрации 5 или 10 мкг / мл, а затем инкубировали при 37 ° C в течение 48 часов, используя 0.1% ДМСО в качестве отрицательного контроля. Поглощение при 490 нм измеряли с использованием ридера для ELISA. Относительную жизнеспособность клеток рассчитывали путем деления оптической плотности обработанных клеток на оптическую плотность необработанных клеток в каждом эксперименте.

DPC, высеянные в 6-луночные планшеты с плотностью 2,5 × 10 ⁵ клеток / лунку обрабатывали 5 или 10 мкг / мл 6-гингерола или 0,1% ДМСО в качестве контроля в течение 48 часов. Апоптоз клеток исследовали с использованием набора для обнаружения аннексина V (Caltag-Medsystems Ltd., Buckingham, UK) в соответствии с инструкциями производителя.Сбор и анализ данных проводились на цитометре FACSort (FAC-SCA, New York, NY). Минимум 2,5 × 10 ⁵ событий клеток было получено для каждой группы в процессе анализа, и каждый эксперимент повторяли не менее 3 раз.

2.4 Вестерн-блоттинг

И контрольные, и обработанные 6-гингеролом DPC собирали через 48 часов после обработки. Готовили полные клеточные лизаты и 30 мкг белка подвергали электрофорезу в додецилсульфате натрия / полиакриламидном геле (SDS-PAGE) с последующим иммуноблот-анализом.Первичные антитела инкубировали при соответствующих разведениях: моноклональное антитело против Bcl-2, 1: 500; моноклональное антитело против Bax, 1: 500; и моноклональное антитело против GAPDH, 1: 1000 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Санта-Крус, Калифорния). Иммунные комплексы детектировали с использованием набора для вестерн-блоттинга с усиленной хемилюминесценцией (ECL) (Santa Cruz) и количественно определяли с использованием программного обеспечения для денситометрии аналитик / ПК (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

2.5 Анализ 6-гингерола in vivo

Всего 36 самок мышей C57BL / 6 (возраст 8 недель) были приобретены в Центре экспериментальных животных Южного медицинского университета (Гуанчжоу, Китай) и случайным образом разделены на 3 группы (12 /группа).Анаген был индуцирован депиляцией кожи на спине мышей C57BL / 6, которые находились в фазе телогена цикла, как описано [19]. Вкратце, волосы удаляли путем местного применения тиогликолата кальция. Со следующего дня (день 1) 0,2 мл 0,1 мг / мл или 1 мг / мл 6-гингерола в 75% (об. / Об.) Этаноле наносили на кожу спины каждого животного каждый день в течение 10 дней. Контрольные животные получали только раствор носителя. Каждые 5 дней после депиляции за спиной каждой мыши наблюдали и фотографировали.Все эксперименты длились 20 дней, после чего мышей умерщвляли. Гистологию образцов кожи, взятых со спины каждой мыши, исследовали с помощью окрашивания гематоксилином и эозином (H&E). Все экспериментальные манипуляции проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения и с одобрения Комитета по этике экспериментальных животных Южного медицинского университета.

2.6 Статистический анализ

Все данные выражены как среднее ± стандартное отклонение от трех независимых экспериментов.Весь статистический анализ проводился с помощью SPSS 13.0. Различия между экспериментальными группами оценивали с помощью теста Стьюдента t . Статистически значимая разница была установлена ​​на уровне P <0,05.

Результаты

3.1 6-гингерол значительно подавляет рост DPC и индуцирует апоптоз клеток

Чтобы изучить влияние 6-гингерола на пролиферацию DPC, мы обрабатывали DPC ДМСО (контроль) или 6-гингеролом (5 или 10 мкг / мл). В течение 48 часов культивирования 6-гингерол проявлял значительный дозозависимый ингибирующий эффект на DPC ().Чтобы определить механизмы, лежащие в основе роста ингибированных 6-гингеролом DPC, влияние 6-гингерола на апоптоз клеток оценивали путем окрашивания флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) и аннексином V. Соответственно, воздействие 6-гингерола на DPC значительно увеличивало апоптоз клеток. по сравнению с контрольной группой, что позволяет предположить, что апоптоз является механизмом, лежащим в основе цитотоксичности, вызванной 6-гингеролом ().

DPC культивировали с различными концентрациями 6-гингерола в течение 48 часов. По сравнению с контролем, обработанным носителем, обработка 10 мкг / мл 6-гингерола значительно ингибировала пролиферацию клеток. (А) Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа МТТ. * P <0,05 по сравнению с контролем, обработанным носителем. (B) Анализ клеток на апоптоз.

3.2 Влияние лечения 6-гингеролом на регуляторные белки апоптоза

Ранее было показано, что 6-гингерол вызывает апоптоз через путь гибели митохондрий [20] — [22].Поскольку известно, что этот путь апоптоза регулируется балансом анти- и проапоптотических белков семейства Bcl-2 [23], [24], мы исследовали уровень экспрессии двух ключевых белков семейства Bcl-2 Bcl. -2 и Bax в ответ на обработку DPC 6-гингеролом. Исследования иммуноблоттинга показывают, что 6-гингерол индуцировал значительное подавление антиапоптотического белка Bcl-2 и повышение проапоптотического белка Bax по сравнению с контролем, обработанным носителем. Кроме того, уровень белка Bax был повышен дозозависимым образом от 6-гингерола ( P <0.05) ().

(A) DPC обрабатывали указанными концентрациями 6-гингерола (0,1% ДМСО контроль) в течение 48 часов и подвергали вестерн-блоттингу. Показаны репрезентативные полосы. (B) Гистограммы, показывающие количественную оценку полос вестерн-блоттинга. GAPDH использовался в качестве внутреннего контроля. * P <0,05 по сравнению с контрольной (0,1% ДМСО) группой.

3,3 6-гингерол подавляет удлинение стержня волоса в культивируемых волосяных фолликулах человека

Поскольку DP играет ключевую роль в регуляции роста волос, мы исследовали влияние 6-гингерола на удлинение стержня волоса. Волосяные фолликулы кожи головы человека выделяли и культивировали как в отсутствие, так и в присутствии 6-гингерола. Мы наблюдали, что 20 мкг / мл 6-гингерола значительно подавляют удлинение стержней волос (и).

Волосяные фолликулы обрабатывали 6-гингеролом в различных концентрациях в течение 7 дней, а удлинение стержней человеческих волос измеряли с помощью калиброванной сетки окуляра в световом микроскопе при увеличении 20 ×.(n = 60)

Таблица 1

Удлинение стержней волос при указанной обработке (n = 60).

Лечение	Длина стержня волоса (мм)	* п.
Контроль (0,1% (об. / Об.) ДМСО)	1,48 ± 0,20
6-гингерол (10 мкг / мл)	1,41 ± 0,23	0,11	0,11	1.06 ± 0,21	0,00

3,4 6-гингерол задерживает индукцию анагена из телогена у мышей

Приведенные выше результаты показывают только влияние 6-гингерола на культивированные DPC и волосяные фолликулы in vitro , что не так же, как и ситуация на месте. Чтобы преодолеть это ограничение, мы оценили роль 6-гингерола в росте волос in vivo с использованием мышей C57BL / 6 в возрасте 8 недель. Когда волосяные фолликулы дорсальной шерсти находились в фазе телогена, мышей брили на спине и выбирали тех, у которых была однородная кожа на стадии телогена. Кожу спины обрабатывали только носителем (контроль) или 6-гингеролом каждый день в течение 10 дней. показывает возобновление роста волос с 5-дневными интервалами для контроля и для лечения 6-гингеролом (например, 1 мг / мл 6-гингерола). У нормальных контрольных мышей наблюдали слабый рост волос через 10 дней после депиляции. Стало очевидно, что шерсть у мышей полностью отросла до исходного состояния в течение ~ 20 дней. После местного применения 6-гингерола в концентрации 1 мг / мл, слабый рост волос наблюдался через 15 дней после депиляции, а редкий рост волос наблюдался через 20 дней после депиляции.Влияние 6-гингерола на плотность волосяных фолликулов дополнительно оценивали путем окрашивания H&E. Соответственно, местное применение 6-гингерола может значительно уменьшить количество волосяных фолликулов по сравнению с контрольной группой ().

После депиляции кожу спины обрабатывали носителем (справа) или 6-гингеролом в концентрации 1 мг / мл (слева) каждый день в течение 10 дней. Фотографии каждого животного делались каждые 5 дней.По сравнению с контролем, обработанным носителем, 6-гингерол в дозе 1 мг / мл может значительно ингибировать индукцию анагена телогеном. (A) нулевой день, (B) 5 дней, (C) 10 дней, (D) 15 дней и (E) 20 дней после депиляции. (F) Увеличенная фотография левой мыши в (E).

После депиляции спины кожу обрабатывали только носителем (контроль) или 1 мг / мл 6-гингерола каждый день в течение 10 дней. Действие 6-гингерола на волосяные фолликулы анализировали с помощью окрашивания H&E через 20 дней после депиляции.(а) — (в) Продольные срезы спинной кожи. (б) — (г) Поперечные срезы спинной кожи. Каждая шкала соответствует 200 мкм.

Обсуждение

Имбирь ( Z. officinale ) традиционно использовался в Восточной Азии для предотвращения выпадения волос и стимуляции роста волос. В настоящее время несколько компаний производят шампуни, содержащие экстракт имбиря, и заявляют, что он обладает эффектом против выпадения и роста волос [9], [10]; однако нет убедительных доказательств, подтверждающих заявленное влияние имбиря на рост волос. В этом исследовании было обнаружено, что 6-гингерол, основной активный компонент имбиря, значительно подавляет рост волос как in vitro , так и in vivo . Насколько нам известно, настоящее исследование является первым, в котором оценивается влияние 6-гингерола на рост волос. Наши результаты показывают, что 6-гингерол не способствует росту волос и может подавлять рост волос, вызывая апоптотические эффекты на DPC (уменьшая соотношение Bcl-2 / Bax).

Мы обнаружили, что 6-гингерол в диапазоне концентраций 5–10 мкг / мл вызывает значительное дозозависимое ингибирование пролиферации человеческих DPC ex vivo.Более того, 20 мкг / мл 6-гингерола значительно подавляли удлинение стержня волоса (1,06 ± 0,21 мм) по сравнению с контрольной группой (1,48 ± 0,20 мм).

Было показано, что 6-гингерол индуцирует апоптоз в основном за счет стимуляции митохондриального (внутреннего) пути гибели [20] — [22], который регулируется в основном белками семейства Bcl-2, в частности проапоптотическим Bax и антиапоптотическим Белки Bcl-2 [23], [24]. Принято считать, что Bcl-2 защищает клетки от апоптоза и что активность Bcl-2 определяется взаимодействием с Bax [25].Интересно, что Bcl-2 и Bax, как было показано, регулируют апоптоз волосяных фолликулов во время фазы регрессии цикла волос, вызванной апоптозом (катаген) [26], [27]. Эти данные привели к гипотезе о том, что 6-гингерол индуцирует апоптоз в клетках волосяных фолликулов, регулируя уровни Bcl-2 и Bax. В этом исследовании мы показали, что 6-гингерол влияет на экспрессию Bcl-2 и Bax в культивируемых человеческих DPC. Мы обнаружили, что 6-гингерол увеличивает Bax и снижает экспрессию Bcl-2 в культивируемых DPC. Обработка 6-гингеролом в течение 48 часов индуцировала значительное увеличение экспрессии Bax и снижение экспрессии Bcl-2 по сравнению с контрольной группой.Кроме того, белок Bax был активирован в зависимости от дозы 6-гингерола. На основании результатов этого и более ранних исследований [4], [12], [13], [26], [27] мы предполагаем, что 6-гингерол вызывает апоптоз в DPC, снижая уровень Bcl-2 и повышение уровня Bax.

Мы подтвердили, что 6-гингерол подавляет удлинение стержня волоса ex vivo, вызывая апоптотическое повреждение в DPC, но неясно, может ли 6-гингерол проникать в волосяные фолликулы и вызывать апоптотическое повреждение в DPC in vivo .По сравнению с ситуацией ex vivo, DPC в волосяных фолликулах in situ обладают более высокой устойчивостью к факторам повреждения [28]; Таким образом, чтобы определить, произошли ли наблюдаемые ex vivo изменения in vivo , мы исследовали ингибирующую рост волос активность 6-гингерола на 8-недельных мышах C57BL / 6 в стабильной и последовательной фазе телогена [19]. На выбритую кожу спины мышей C57BL / 6 ежедневно наносили местно 6-гингерол в течение 10 дней. У нормальных контрольных мышей слабый рост волос наблюдался через 10 дней, а полный рост наблюдался через 20 дней после депиляции.Однако в группе, получавшей 1 мг / мл 6-гингерола, через 15 дней наблюдалось только слабое отрастание волос, а через 20 дней после депиляции — редкое отрастание. Для дальнейшего изучения ингибирования роста волос мы оценили влияние 6-гингерола на плотность волосяных фолликулов путем окрашивания (H&E). Соответственно, местное применение 6-гингерола в концентрации 1 мг / мл может существенно уменьшить количество волосяных фолликулов по сравнению с контрольной группой. Таким образом, было подтверждено, что первоначально наблюдаемые события in vitro фактически произошли in vivo .

Нежелательные волосы на теле могут быть эмоционально и социально разрушительными [29], что требует поиска различных методов лечения. Самый простой и популярный метод — это использование средств для депиляции, которые химически удаляют волосы с поверхности кожи, растворяя кератин, но имеют только временный эффект. К сожалению, есть некоторые побочные эффекты, такие как кожная аллергия, парадоксальный гипертрихоз или ожог кожи [30]. Согласно результатам настоящего исследования, 6-гингерол может снижать плотность волосяных фолликулов, вызывая апоптотические эффекты на DPC, и является потенциальным лекарством для стойкого удаления волос.

Таким образом, мы впервые сообщаем, что 6-гингерол не влияет на стимуляцию роста волос, напротив, может подавлять рост человеческих волос за счет своего ингибирующего и проапоптотического действия на DPC in vitro и вызывать пролонгирование фазы телогена in vivo . Таким образом, 6-гингерол является скорее лекарством, не стимулирующим рост волос, а потенциальным лекарственным средством, подавляющим рост волос; т.е. для удаления волос. Недостатки этого исследования заключаются в том, что в нем было немного меньше случаев, неизвестный эффект 6-гингерола на фолликулярные эпителиальные клетки и генетические изменения 6-гингерола на клетки сосочков дермы in vivo .Поэтому в будущих экспериментах, помимо увеличения размера выборки, мы должны проводить дальнейшие эксперименты для решения вышеупомянутых проблем.

Благодарности

Авторы благодарят Shengqi Wang, Boxin Zhao, Jindou Jiang, Zhehua Li и Zhidan Zhang за их техническую поддержку и критические обсуждения.

Отчет о финансировании

Эта работа была поддержана Китайским фондом естественных наук (грант № 31170949). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Список литературы

6-Гингерол подавляет рост стержня волос в культивируемых фолликулах волос человека и модулирует рост волос у мышей

PLoS One. 2013; 8 (2): e57226.

Юн Мяо

¹ Отделение пластической и эстетической хирургии, больница Нанфанг, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

Ябин Сан

² Офис GCP, Больница Нанфанг, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

Вэньцзюнь Ван

³ Институт исследования рака, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

Benjun Du

¹ Отделение пластической и эстетической хирургии, больница Нанфанг, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

Шун-э Сяо

¹ Отделение пластической и эстетической хирургии, больница Нанфанг, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

Ицзюэ Ху

¹ Отделение пластической и эстетической хирургии, больница Нанфанг, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

Чжици Ху

¹ Отделение пластической и эстетической хирургии, больница Нанфанг, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

Майкл Хэмблин, редактор

¹ Отделение пластической и эстетической хирургии, больница Нанфанг, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

² Офис GCP, Больница Нанфанг, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

³ Институт исследования рака, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

MGH, MMS, Соединенные Штаты Америки,

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Задумал и спроектировал эксперименты: ZH YM. Проведены эксперименты: YM YS SX. Проанализированы данные: WW BD. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: YH YS. Написал статью: Ю.М.

Поступила 28 июля 2012 г .; Принято 18 января 2013 г.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии надлежащего указания автора и источника.

Abstract

Имбирь ( Zingiber officinale ) традиционно используется для сдерживания выпадения и стимуляции роста волос в Восточной Азии. Несколько компаний производят шампунь, содержащий экстракт имбиря, который, как утверждается, обладает свойствами против выпадения и стимулирования роста волос. Однако нет никаких научных доказательств, подтверждающих эти утверждения. Это исследование было предпринято для измерения 6-гингерола, основного активного компонента имбиря, на удлинение стержня волоса in vitro и рост волос in vivo , а также для изучения его влияния на клетки дермального сосочка человека (DPC) in vivo и in vitro. 6-Гингерол подавлял рост волос в волосяных фолликулах в культуре и пролиферацию культивированных DPC. Ингибирование роста DPC 6-гингеролом in vitro может отражать снижение отношения Bcl-2 / Bax. Аналогичные результаты были получены in vivo . Результаты этого исследования показали, что 6-гингерол не обладает способностью стимулировать рост волос, напротив, может подавлять рост человеческих волос за счет своего ингибирующего и проапоптотического воздействия на DPC in vitro и может вызывать удлинение телогена. фаза in vivo .Таким образом, 6-гингерол является скорее лекарством, не стимулирующим рост волос, а потенциальным лекарственным средством, подавляющим рост волос; т.е. для удаления волос.

Введение

Волосяной фолликул млекопитающих содержит дермальный сосочек (DP), который в основном состоит из DP-клеток (DPC), и дермальную оболочку, происходящую из мезенхимы, а также эпителиальные клетки наружной корневой оболочки, внутренней корневой оболочки, матрицы и стержня волоса происходит из эпителия [11].Постнатальный волосяной фолликул проходит цикл анагена (фаза роста), катагена (фаза регресса) и телогена (фаза покоя). Взаимные взаимодействия между эпителием и мезенхимой важны для послеродового роста волос и цикличности волосяных фолликулов. DP, как известно, играет ключевую роль в регуляции роста волос и цикличности [11]. Таким образом, любой фактор, который влияет на функции DPC, может влиять на рост волос. Например, миноксидил [12] и эпигаллокатехин-3-галлат [4] стимулируют рост волос, оказывая свое антиапоптотическое действие на DPC (за счет увеличения соотношения Bcl-2 / Bax), это один из механизмов воздействия на Миноксидил.С другой стороны, цисплатин [13] приводит к выпадению волос, вызывая апоптотические эффекты на DPC (за счет уменьшения отношения Bcl-2 / Bax).

В последнее время было проведено несколько научных исследований, направленных на выделение и идентификацию активных компонентов имбиря, а также на научную проверку его фармакологического действия и действия его составляющих [14], [15]. Результаты показывают, что 6-гингерол является наиболее распространенным активным компонентом и обладает различными фармакологическими и микробиологическими эффектами, включая противоопухолевое, противовоспалительное, антиоксидантное и противорвотное действие; Однако фармакологические эффекты 6-гингерола на рост волос научно не доказаны.

В этом исследовании мы исследовали эффекты 6-гингерола на человеческие DPC и рост волосяного стержня ex vivo и рост волос у мышей.

Материалы и методы

2.1. Выделение и культивирование волосяных фолликулов человека

Образцы пункционной биопсии (4 мм) были взяты с неболедых затылочных костей головы пациентов, перенесших операцию по трансплантации волос по поводу андрогенной алопеции. Медицинский этический комитет Южного медицинского университета одобрил все исследования, описанные здесь.Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией принципов, и от всех пациентов было получено информированное письменное согласие. Волосяные фолликулы выделяли и культивировали, как описано Philpott et al [16]. Вкратце, волосяные фолликулы выделяли щипцами под бинокулярным световым микроскопом и культивировали в 24-луночных чашках в течение 7 дней в среде Williams E (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) с добавлением 10 нг / мл гидрокортизона, 10 мг / мл инсулина 2. мМ L-глутамин, 100 Ед / мл стрептомицина и 10 нг / мл гидрокортизона при 37 ° C в атмосфере 5% (об. / об.) CO ₂ .6-Гингерол (чистота> 95%; Sigma Chemical Co., Сент-Луис, Миссури) растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО; Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Пекин, Китай) и для сохранения конечной концентрации носителя < 0,1%. 6-Гингерол добавляли в культуральную среду в концентрации 10 или 20 мкг / мл, и 0,1% (об. / Об.) ДМСО использовали в качестве контроля. Во всех экспериментах культуральную среду и 6-гингерол обновляли через день. Всего 180 анагенных волосяных фолликулов от 3 разных добровольцев (60 фолликулов / субъект) культивировали при каждом условии роста.Средняя длина волосяного фолликула от дна дермальных сосочков в нулевой день составляла 4,5 мм.

2.2. Культура человеческих DPC

DPC выделяли и культивировали, как описано Magerl et al [17]. Вкратце, кожные сосочки были микродиссектированы с луковиц рассеченных волосяных фолликулов, перенесены на пластиковые чашки и культивированы в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM; Gibco, Grand Island, NY) с добавлением 100 Ед / мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицина и 20 мг / мл. % (об. / об.) фетальной бычьей сыворотки (FBS; Gibco) при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO ₂ .Эксплантаты выдерживали в среде в течение 7 дней, среду меняли каждые 3 дня. Когда рост клеток становился субконфлюэнтным, клетки собирали с 0,25% (мас. / Об.) Трипсин-ЭДТА (Invitrogen, Carlsbad, CA) и субкультивировали с соотношением деления 1: 3. После этого DPC поддерживали в DMEM с добавлением 10% FBS.

2.3 Анализы пролиферации клеток и апоптоза

Пролиферацию клеток определяли с помощью анализа МТТ, как описано Мосманном [18]. Вкратце, DPC (3 × 10 ⁴ клеток / лунку) высевали в 96-луночные планшеты и инкубировали в течение 24 часов перед добавлением 6-гингерола в концентрации 5 или 10 мкг / мл, а затем инкубировали при 37 ° C в течение 48 часов, используя 0.1% ДМСО в качестве отрицательного контроля. Поглощение при 490 нм измеряли с использованием ридера для ELISA. Относительную жизнеспособность клеток рассчитывали путем деления оптической плотности обработанных клеток на оптическую плотность необработанных клеток в каждом эксперименте.

DPC, высеянные в 6-луночные планшеты с плотностью 2,5 × 10 ⁵ клеток / лунку обрабатывали 5 или 10 мкг / мл 6-гингерола или 0,1% ДМСО в качестве контроля в течение 48 часов. Апоптоз клеток исследовали с использованием набора для обнаружения аннексина V (Caltag-Medsystems Ltd., Buckingham, UK) в соответствии с инструкциями производителя.Сбор и анализ данных проводились на цитометре FACSort (FAC-SCA, New York, NY). Минимум 2,5 × 10 ⁵ событий клеток было получено для каждой группы в процессе анализа, и каждый эксперимент повторяли не менее 3 раз.

2.4 Вестерн-блоттинг

И контрольные, и обработанные 6-гингеролом DPC собирали через 48 часов после обработки. Готовили полные клеточные лизаты и 30 мкг белка подвергали электрофорезу в додецилсульфате натрия / полиакриламидном геле (SDS-PAGE) с последующим иммуноблот-анализом.Первичные антитела инкубировали при соответствующих разведениях: моноклональное антитело против Bcl-2, 1: 500; моноклональное антитело против Bax, 1: 500; и моноклональное антитело против GAPDH, 1: 1000 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Санта-Крус, Калифорния). Иммунные комплексы детектировали с использованием набора для вестерн-блоттинга с усиленной хемилюминесценцией (ECL) (Santa Cruz) и количественно определяли с использованием программного обеспечения для денситометрии аналитик / ПК (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

2.5 Анализ 6-гингерола in vivo

Всего 36 самок мышей C57BL / 6 (возраст 8 недель) были приобретены в Центре экспериментальных животных Южного медицинского университета (Гуанчжоу, Китай) и случайным образом разделены на 3 группы (12 /группа).Анаген был индуцирован депиляцией кожи на спине мышей C57BL / 6, которые находились в фазе телогена цикла, как описано [19]. Вкратце, волосы удаляли путем местного применения тиогликолата кальция. Со следующего дня (день 1) 0,2 мл 0,1 мг / мл или 1 мг / мл 6-гингерола в 75% (об. / Об.) Этаноле наносили на кожу спины каждого животного каждый день в течение 10 дней. Контрольные животные получали только раствор носителя. Каждые 5 дней после депиляции за спиной каждой мыши наблюдали и фотографировали.Все эксперименты длились 20 дней, после чего мышей умерщвляли. Гистологию образцов кожи, взятых со спины каждой мыши, исследовали с помощью окрашивания гематоксилином и эозином (H&E). Все экспериментальные манипуляции проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения и с одобрения Комитета по этике экспериментальных животных Южного медицинского университета.

2.6 Статистический анализ

Все данные выражены как среднее ± стандартное отклонение от трех независимых экспериментов.Весь статистический анализ проводился с помощью SPSS 13.0. Различия между экспериментальными группами оценивали с помощью теста Стьюдента t . Статистически значимая разница была установлена ​​на уровне P <0,05.

Результаты

3.1 6-гингерол значительно подавляет рост DPC и индуцирует апоптоз клеток

Чтобы изучить влияние 6-гингерола на пролиферацию DPC, мы обрабатывали DPC ДМСО (контроль) или 6-гингеролом (5 или 10 мкг / мл). В течение 48 часов культивирования 6-гингерол проявлял значительный дозозависимый ингибирующий эффект на DPC ().Чтобы определить механизмы, лежащие в основе роста ингибированных 6-гингеролом DPC, влияние 6-гингерола на апоптоз клеток оценивали путем окрашивания флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) и аннексином V. Соответственно, воздействие 6-гингерола на DPC значительно увеличивало апоптоз клеток. по сравнению с контрольной группой, что позволяет предположить, что апоптоз является механизмом, лежащим в основе цитотоксичности, вызванной 6-гингеролом ().

DPC культивировали с различными концентрациями 6-гингерола в течение 48 часов. По сравнению с контролем, обработанным носителем, обработка 10 мкг / мл 6-гингерола значительно ингибировала пролиферацию клеток. (А) Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа МТТ. * P <0,05 по сравнению с контролем, обработанным носителем. (B) Анализ клеток на апоптоз.

3.2 Влияние лечения 6-гингеролом на регуляторные белки апоптоза

Ранее было показано, что 6-гингерол вызывает апоптоз через путь гибели митохондрий [20] — [22].Поскольку известно, что этот путь апоптоза регулируется балансом анти- и проапоптотических белков семейства Bcl-2 [23], [24], мы исследовали уровень экспрессии двух ключевых белков семейства Bcl-2 Bcl. -2 и Bax в ответ на обработку DPC 6-гингеролом. Исследования иммуноблоттинга показывают, что 6-гингерол индуцировал значительное подавление антиапоптотического белка Bcl-2 и повышение проапоптотического белка Bax по сравнению с контролем, обработанным носителем. Кроме того, уровень белка Bax был повышен дозозависимым образом от 6-гингерола ( P <0.05) ().

(A) DPC обрабатывали указанными концентрациями 6-гингерола (0,1% ДМСО контроль) в течение 48 часов и подвергали вестерн-блоттингу. Показаны репрезентативные полосы. (B) Гистограммы, показывающие количественную оценку полос вестерн-блоттинга. GAPDH использовался в качестве внутреннего контроля. * P <0,05 по сравнению с контрольной (0,1% ДМСО) группой.

3,3 6-гингерол подавляет удлинение стержня волоса в культивируемых волосяных фолликулах человека

Поскольку DP играет ключевую роль в регуляции роста волос, мы исследовали влияние 6-гингерола на удлинение стержня волоса. Волосяные фолликулы кожи головы человека выделяли и культивировали как в отсутствие, так и в присутствии 6-гингерола. Мы наблюдали, что 20 мкг / мл 6-гингерола значительно подавляют удлинение стержней волос (и).

Волосяные фолликулы обрабатывали 6-гингеролом в различных концентрациях в течение 7 дней, а удлинение стержней человеческих волос измеряли с помощью калиброванной сетки окуляра в световом микроскопе при увеличении 20 ×.(n = 60)

Таблица 1

Удлинение стержней волос при указанной обработке (n = 60).

Лечение	Длина стержня волоса (мм)	* п.
Контроль (0,1% (об. / Об.) ДМСО)	1,48 ± 0,20
6-гингерол (10 мкг / мл)	1,41 ± 0,23	0,11	0,11	1.06 ± 0,21	0,00

3,4 6-гингерол задерживает индукцию анагена из телогена у мышей

Приведенные выше результаты показывают только влияние 6-гингерола на культивированные DPC и волосяные фолликулы in vitro , что не так же, как и ситуация на месте. Чтобы преодолеть это ограничение, мы оценили роль 6-гингерола в росте волос in vivo с использованием мышей C57BL / 6 в возрасте 8 недель. Когда волосяные фолликулы дорсальной шерсти находились в фазе телогена, мышей брили на спине и выбирали тех, у которых была однородная кожа на стадии телогена. Кожу спины обрабатывали только носителем (контроль) или 6-гингеролом каждый день в течение 10 дней. показывает возобновление роста волос с 5-дневными интервалами для контроля и для лечения 6-гингеролом (например, 1 мг / мл 6-гингерола). У нормальных контрольных мышей наблюдали слабый рост волос через 10 дней после депиляции. Стало очевидно, что шерсть у мышей полностью отросла до исходного состояния в течение ~ 20 дней. После местного применения 6-гингерола в концентрации 1 мг / мл, слабый рост волос наблюдался через 15 дней после депиляции, а редкий рост волос наблюдался через 20 дней после депиляции.Влияние 6-гингерола на плотность волосяных фолликулов дополнительно оценивали путем окрашивания H&E. Соответственно, местное применение 6-гингерола может значительно уменьшить количество волосяных фолликулов по сравнению с контрольной группой ().

После депиляции кожу спины обрабатывали носителем (справа) или 6-гингеролом в концентрации 1 мг / мл (слева) каждый день в течение 10 дней. Фотографии каждого животного делались каждые 5 дней.По сравнению с контролем, обработанным носителем, 6-гингерол в дозе 1 мг / мл может значительно ингибировать индукцию анагена телогеном. (A) нулевой день, (B) 5 дней, (C) 10 дней, (D) 15 дней и (E) 20 дней после депиляции. (F) Увеличенная фотография левой мыши в (E).

После депиляции спины кожу обрабатывали только носителем (контроль) или 1 мг / мл 6-гингерола каждый день в течение 10 дней. Действие 6-гингерола на волосяные фолликулы анализировали с помощью окрашивания H&E через 20 дней после депиляции.(а) — (в) Продольные срезы спинной кожи. (б) — (г) Поперечные срезы спинной кожи. Каждая шкала соответствует 200 мкм.

Обсуждение

Имбирь ( Z. officinale ) традиционно использовался в Восточной Азии для предотвращения выпадения волос и стимуляции роста волос. В настоящее время несколько компаний производят шампуни, содержащие экстракт имбиря, и заявляют, что он обладает эффектом против выпадения и роста волос [9], [10]; однако нет убедительных доказательств, подтверждающих заявленное влияние имбиря на рост волос. В этом исследовании было обнаружено, что 6-гингерол, основной активный компонент имбиря, значительно подавляет рост волос как in vitro , так и in vivo . Насколько нам известно, настоящее исследование является первым, в котором оценивается влияние 6-гингерола на рост волос. Наши результаты показывают, что 6-гингерол не способствует росту волос и может подавлять рост волос, вызывая апоптотические эффекты на DPC (уменьшая соотношение Bcl-2 / Bax).

Мы обнаружили, что 6-гингерол в диапазоне концентраций 5–10 мкг / мл вызывает значительное дозозависимое ингибирование пролиферации человеческих DPC ex vivo.Более того, 20 мкг / мл 6-гингерола значительно подавляли удлинение стержня волоса (1,06 ± 0,21 мм) по сравнению с контрольной группой (1,48 ± 0,20 мм).

Было показано, что 6-гингерол индуцирует апоптоз в основном за счет стимуляции митохондриального (внутреннего) пути гибели [20] — [22], который регулируется в основном белками семейства Bcl-2, в частности проапоптотическим Bax и антиапоптотическим Белки Bcl-2 [23], [24]. Принято считать, что Bcl-2 защищает клетки от апоптоза и что активность Bcl-2 определяется взаимодействием с Bax [25].Интересно, что Bcl-2 и Bax, как было показано, регулируют апоптоз волосяных фолликулов во время фазы регрессии цикла волос, вызванной апоптозом (катаген) [26], [27]. Эти данные привели к гипотезе о том, что 6-гингерол индуцирует апоптоз в клетках волосяных фолликулов, регулируя уровни Bcl-2 и Bax. В этом исследовании мы показали, что 6-гингерол влияет на экспрессию Bcl-2 и Bax в культивируемых человеческих DPC. Мы обнаружили, что 6-гингерол увеличивает Bax и снижает экспрессию Bcl-2 в культивируемых DPC. Обработка 6-гингеролом в течение 48 часов индуцировала значительное увеличение экспрессии Bax и снижение экспрессии Bcl-2 по сравнению с контрольной группой.Кроме того, белок Bax был активирован в зависимости от дозы 6-гингерола. На основании результатов этого и более ранних исследований [4], [12], [13], [26], [27] мы предполагаем, что 6-гингерол вызывает апоптоз в DPC, снижая уровень Bcl-2 и повышение уровня Bax.

Мы подтвердили, что 6-гингерол подавляет удлинение стержня волоса ex vivo, вызывая апоптотическое повреждение в DPC, но неясно, может ли 6-гингерол проникать в волосяные фолликулы и вызывать апоптотическое повреждение в DPC in vivo .По сравнению с ситуацией ex vivo, DPC в волосяных фолликулах in situ обладают более высокой устойчивостью к факторам повреждения [28]; Таким образом, чтобы определить, произошли ли наблюдаемые ex vivo изменения in vivo , мы исследовали ингибирующую рост волос активность 6-гингерола на 8-недельных мышах C57BL / 6 в стабильной и последовательной фазе телогена [19]. На выбритую кожу спины мышей C57BL / 6 ежедневно наносили местно 6-гингерол в течение 10 дней. У нормальных контрольных мышей слабый рост волос наблюдался через 10 дней, а полный рост наблюдался через 20 дней после депиляции.Однако в группе, получавшей 1 мг / мл 6-гингерола, через 15 дней наблюдалось только слабое отрастание волос, а через 20 дней после депиляции — редкое отрастание. Для дальнейшего изучения ингибирования роста волос мы оценили влияние 6-гингерола на плотность волосяных фолликулов путем окрашивания (H&E). Соответственно, местное применение 6-гингерола в концентрации 1 мг / мл может существенно уменьшить количество волосяных фолликулов по сравнению с контрольной группой. Таким образом, было подтверждено, что первоначально наблюдаемые события in vitro фактически произошли in vivo .

Нежелательные волосы на теле могут быть эмоционально и социально разрушительными [29], что требует поиска различных методов лечения. Самый простой и популярный метод — это использование средств для депиляции, которые химически удаляют волосы с поверхности кожи, растворяя кератин, но имеют только временный эффект. К сожалению, есть некоторые побочные эффекты, такие как кожная аллергия, парадоксальный гипертрихоз или ожог кожи [30]. Согласно результатам настоящего исследования, 6-гингерол может снижать плотность волосяных фолликулов, вызывая апоптотические эффекты на DPC, и является потенциальным лекарством для стойкого удаления волос.

Таким образом, мы впервые сообщаем, что 6-гингерол не влияет на стимуляцию роста волос, напротив, может подавлять рост человеческих волос за счет своего ингибирующего и проапоптотического действия на DPC in vitro и вызывать пролонгирование фазы телогена in vivo . Таким образом, 6-гингерол является скорее лекарством, не стимулирующим рост волос, а потенциальным лекарственным средством, подавляющим рост волос; т.е. для удаления волос. Недостатки этого исследования заключаются в том, что в нем было немного меньше случаев, неизвестный эффект 6-гингерола на фолликулярные эпителиальные клетки и генетические изменения 6-гингерола на клетки сосочков дермы in vivo .Поэтому в будущих экспериментах, помимо увеличения размера выборки, мы должны проводить дальнейшие эксперименты для решения вышеупомянутых проблем.

Благодарности

Авторы благодарят Shengqi Wang, Boxin Zhao, Jindou Jiang, Zhehua Li и Zhidan Zhang за их техническую поддержку и критические обсуждения.

Отчет о финансировании

Эта работа была поддержана Китайским фондом естественных наук (грант № 31170949). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Список литературы

6-Гингерол подавляет рост стержня волос в культивируемых фолликулах волос человека и модулирует рост волос у мышей

PLoS One. 2013; 8 (2): e57226.

Юн Мяо

¹ Отделение пластической и эстетической хирургии, больница Нанфанг, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

Ябин Сан

² Офис GCP, Больница Нанфанг, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

Вэньцзюнь Ван

³ Институт исследования рака, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

Benjun Du

¹ Отделение пластической и эстетической хирургии, больница Нанфанг, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

Шун-э Сяо

¹ Отделение пластической и эстетической хирургии, больница Нанфанг, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

Ицзюэ Ху

¹ Отделение пластической и эстетической хирургии, больница Нанфанг, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

Чжици Ху

¹ Отделение пластической и эстетической хирургии, больница Нанфанг, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

Майкл Хэмблин, редактор

¹ Отделение пластической и эстетической хирургии, больница Нанфанг, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

² Офис GCP, Больница Нанфанг, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

³ Институт исследования рака, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

MGH, MMS, Соединенные Штаты Америки,

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Задумал и спроектировал эксперименты: ZH YM. Проведены эксперименты: YM YS SX. Проанализированы данные: WW BD. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: YH YS. Написал статью: Ю.М.

Поступила 28 июля 2012 г .; Принято 18 января 2013 г.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии надлежащего указания автора и источника.

Abstract

Имбирь ( Zingiber officinale ) традиционно используется для сдерживания выпадения и стимуляции роста волос в Восточной Азии. Несколько компаний производят шампунь, содержащий экстракт имбиря, который, как утверждается, обладает свойствами против выпадения и стимулирования роста волос. Однако нет никаких научных доказательств, подтверждающих эти утверждения. Это исследование было предпринято для измерения 6-гингерола, основного активного компонента имбиря, на удлинение стержня волоса in vitro и рост волос in vivo , а также для изучения его влияния на клетки дермального сосочка человека (DPC) in vivo и in vitro. 6-Гингерол подавлял рост волос в волосяных фолликулах в культуре и пролиферацию культивированных DPC. Ингибирование роста DPC 6-гингеролом in vitro может отражать снижение отношения Bcl-2 / Bax. Аналогичные результаты были получены in vivo . Результаты этого исследования показали, что 6-гингерол не обладает способностью стимулировать рост волос, напротив, может подавлять рост человеческих волос за счет своего ингибирующего и проапоптотического воздействия на DPC in vitro и может вызывать удлинение телогена. фаза in vivo .Таким образом, 6-гингерол является скорее лекарством, не стимулирующим рост волос, а потенциальным лекарственным средством, подавляющим рост волос; т.е. для удаления волос.

Введение

Волосяной фолликул млекопитающих содержит дермальный сосочек (DP), который в основном состоит из DP-клеток (DPC), и дермальную оболочку, происходящую из мезенхимы, а также эпителиальные клетки наружной корневой оболочки, внутренней корневой оболочки, матрицы и стержня волоса происходит из эпителия [11].Постнатальный волосяной фолликул проходит цикл анагена (фаза роста), катагена (фаза регресса) и телогена (фаза покоя). Взаимные взаимодействия между эпителием и мезенхимой важны для послеродового роста волос и цикличности волосяных фолликулов. DP, как известно, играет ключевую роль в регуляции роста волос и цикличности [11]. Таким образом, любой фактор, который влияет на функции DPC, может влиять на рост волос. Например, миноксидил [12] и эпигаллокатехин-3-галлат [4] стимулируют рост волос, оказывая свое антиапоптотическое действие на DPC (за счет увеличения соотношения Bcl-2 / Bax), это один из механизмов воздействия на Миноксидил.С другой стороны, цисплатин [13] приводит к выпадению волос, вызывая апоптотические эффекты на DPC (за счет уменьшения отношения Bcl-2 / Bax).

В последнее время было проведено несколько научных исследований, направленных на выделение и идентификацию активных компонентов имбиря, а также на научную проверку его фармакологического действия и действия его составляющих [14], [15]. Результаты показывают, что 6-гингерол является наиболее распространенным активным компонентом и обладает различными фармакологическими и микробиологическими эффектами, включая противоопухолевое, противовоспалительное, антиоксидантное и противорвотное действие; Однако фармакологические эффекты 6-гингерола на рост волос научно не доказаны.

В этом исследовании мы исследовали эффекты 6-гингерола на человеческие DPC и рост волосяного стержня ex vivo и рост волос у мышей.

Материалы и методы

2.1. Выделение и культивирование волосяных фолликулов человека

Образцы пункционной биопсии (4 мм) были взяты с неболедых затылочных костей головы пациентов, перенесших операцию по трансплантации волос по поводу андрогенной алопеции. Медицинский этический комитет Южного медицинского университета одобрил все исследования, описанные здесь.Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией принципов, и от всех пациентов было получено информированное письменное согласие. Волосяные фолликулы выделяли и культивировали, как описано Philpott et al [16]. Вкратце, волосяные фолликулы выделяли щипцами под бинокулярным световым микроскопом и культивировали в 24-луночных чашках в течение 7 дней в среде Williams E (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) с добавлением 10 нг / мл гидрокортизона, 10 мг / мл инсулина 2. мМ L-глутамин, 100 Ед / мл стрептомицина и 10 нг / мл гидрокортизона при 37 ° C в атмосфере 5% (об. / об.) CO ₂ .6-Гингерол (чистота> 95%; Sigma Chemical Co., Сент-Луис, Миссури) растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО; Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Пекин, Китай) и для сохранения конечной концентрации носителя < 0,1%. 6-Гингерол добавляли в культуральную среду в концентрации 10 или 20 мкг / мл, и 0,1% (об. / Об.) ДМСО использовали в качестве контроля. Во всех экспериментах культуральную среду и 6-гингерол обновляли через день. Всего 180 анагенных волосяных фолликулов от 3 разных добровольцев (60 фолликулов / субъект) культивировали при каждом условии роста.Средняя длина волосяного фолликула от дна дермальных сосочков в нулевой день составляла 4,5 мм.

2.2. Культура человеческих DPC

DPC выделяли и культивировали, как описано Magerl et al [17]. Вкратце, кожные сосочки были микродиссектированы с луковиц рассеченных волосяных фолликулов, перенесены на пластиковые чашки и культивированы в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM; Gibco, Grand Island, NY) с добавлением 100 Ед / мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицина и 20 мг / мл. % (об. / об.) фетальной бычьей сыворотки (FBS; Gibco) при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO ₂ .Эксплантаты выдерживали в среде в течение 7 дней, среду меняли каждые 3 дня. Когда рост клеток становился субконфлюэнтным, клетки собирали с 0,25% (мас. / Об.) Трипсин-ЭДТА (Invitrogen, Carlsbad, CA) и субкультивировали с соотношением деления 1: 3. После этого DPC поддерживали в DMEM с добавлением 10% FBS.

2.3 Анализы пролиферации клеток и апоптоза

Пролиферацию клеток определяли с помощью анализа МТТ, как описано Мосманном [18]. Вкратце, DPC (3 × 10 ⁴ клеток / лунку) высевали в 96-луночные планшеты и инкубировали в течение 24 часов перед добавлением 6-гингерола в концентрации 5 или 10 мкг / мл, а затем инкубировали при 37 ° C в течение 48 часов, используя 0.1% ДМСО в качестве отрицательного контроля. Поглощение при 490 нм измеряли с использованием ридера для ELISA. Относительную жизнеспособность клеток рассчитывали путем деления оптической плотности обработанных клеток на оптическую плотность необработанных клеток в каждом эксперименте.

DPC, высеянные в 6-луночные планшеты с плотностью 2,5 × 10 ⁵ клеток / лунку обрабатывали 5 или 10 мкг / мл 6-гингерола или 0,1% ДМСО в качестве контроля в течение 48 часов. Апоптоз клеток исследовали с использованием набора для обнаружения аннексина V (Caltag-Medsystems Ltd., Buckingham, UK) в соответствии с инструкциями производителя.Сбор и анализ данных проводились на цитометре FACSort (FAC-SCA, New York, NY). Минимум 2,5 × 10 ⁵ событий клеток было получено для каждой группы в процессе анализа, и каждый эксперимент повторяли не менее 3 раз.

2.4 Вестерн-блоттинг

И контрольные, и обработанные 6-гингеролом DPC собирали через 48 часов после обработки. Готовили полные клеточные лизаты и 30 мкг белка подвергали электрофорезу в додецилсульфате натрия / полиакриламидном геле (SDS-PAGE) с последующим иммуноблот-анализом.Первичные антитела инкубировали при соответствующих разведениях: моноклональное антитело против Bcl-2, 1: 500; моноклональное антитело против Bax, 1: 500; и моноклональное антитело против GAPDH, 1: 1000 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Санта-Крус, Калифорния). Иммунные комплексы детектировали с использованием набора для вестерн-блоттинга с усиленной хемилюминесценцией (ECL) (Santa Cruz) и количественно определяли с использованием программного обеспечения для денситометрии аналитик / ПК (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

2.5 Анализ 6-гингерола in vivo

Всего 36 самок мышей C57BL / 6 (возраст 8 недель) были приобретены в Центре экспериментальных животных Южного медицинского университета (Гуанчжоу, Китай) и случайным образом разделены на 3 группы (12 /группа).Анаген был индуцирован депиляцией кожи на спине мышей C57BL / 6, которые находились в фазе телогена цикла, как описано [19]. Вкратце, волосы удаляли путем местного применения тиогликолата кальция. Со следующего дня (день 1) 0,2 мл 0,1 мг / мл или 1 мг / мл 6-гингерола в 75% (об. / Об.) Этаноле наносили на кожу спины каждого животного каждый день в течение 10 дней. Контрольные животные получали только раствор носителя. Каждые 5 дней после депиляции за спиной каждой мыши наблюдали и фотографировали.Все эксперименты длились 20 дней, после чего мышей умерщвляли. Гистологию образцов кожи, взятых со спины каждой мыши, исследовали с помощью окрашивания гематоксилином и эозином (H&E). Все экспериментальные манипуляции проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения и с одобрения Комитета по этике экспериментальных животных Южного медицинского университета.

2.6 Статистический анализ

Все данные выражены как среднее ± стандартное отклонение от трех независимых экспериментов.Весь статистический анализ проводился с помощью SPSS 13.0. Различия между экспериментальными группами оценивали с помощью теста Стьюдента t . Статистически значимая разница была установлена ​​на уровне P <0,05.

Результаты

3.1 6-гингерол значительно подавляет рост DPC и индуцирует апоптоз клеток

Чтобы изучить влияние 6-гингерола на пролиферацию DPC, мы обрабатывали DPC ДМСО (контроль) или 6-гингеролом (5 или 10 мкг / мл). В течение 48 часов культивирования 6-гингерол проявлял значительный дозозависимый ингибирующий эффект на DPC ().Чтобы определить механизмы, лежащие в основе роста ингибированных 6-гингеролом DPC, влияние 6-гингерола на апоптоз клеток оценивали путем окрашивания флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) и аннексином V. Соответственно, воздействие 6-гингерола на DPC значительно увеличивало апоптоз клеток. по сравнению с контрольной группой, что позволяет предположить, что апоптоз является механизмом, лежащим в основе цитотоксичности, вызванной 6-гингеролом ().

DPC культивировали с различными концентрациями 6-гингерола в течение 48 часов. По сравнению с контролем, обработанным носителем, обработка 10 мкг / мл 6-гингерола значительно ингибировала пролиферацию клеток. (А) Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа МТТ. * P <0,05 по сравнению с контролем, обработанным носителем. (B) Анализ клеток на апоптоз.

3.2 Влияние лечения 6-гингеролом на регуляторные белки апоптоза

Ранее было показано, что 6-гингерол вызывает апоптоз через путь гибели митохондрий [20] — [22].Поскольку известно, что этот путь апоптоза регулируется балансом анти- и проапоптотических белков семейства Bcl-2 [23], [24], мы исследовали уровень экспрессии двух ключевых белков семейства Bcl-2 Bcl. -2 и Bax в ответ на обработку DPC 6-гингеролом. Исследования иммуноблоттинга показывают, что 6-гингерол индуцировал значительное подавление антиапоптотического белка Bcl-2 и повышение проапоптотического белка Bax по сравнению с контролем, обработанным носителем. Кроме того, уровень белка Bax был повышен дозозависимым образом от 6-гингерола ( P <0.05) ().

(A) DPC обрабатывали указанными концентрациями 6-гингерола (0,1% ДМСО контроль) в течение 48 часов и подвергали вестерн-блоттингу. Показаны репрезентативные полосы. (B) Гистограммы, показывающие количественную оценку полос вестерн-блоттинга. GAPDH использовался в качестве внутреннего контроля. * P <0,05 по сравнению с контрольной (0,1% ДМСО) группой.

3,3 6-гингерол подавляет удлинение стержня волоса в культивируемых волосяных фолликулах человека

Поскольку DP играет ключевую роль в регуляции роста волос, мы исследовали влияние 6-гингерола на удлинение стержня волоса.Волосяные фолликулы кожи головы человека выделяли и культивировали как в отсутствие, так и в присутствии 6-гингерола. Мы наблюдали, что 20 мкг / мл 6-гингерола значительно подавляют удлинение стержней волос (и).

Волосяные фолликулы обрабатывали 6-гингеролом в различных концентрациях в течение 7 дней, а удлинение стержней человеческих волос измеряли с помощью калиброванной сетки окуляра в световом микроскопе при увеличении 20 ×.(n = 60)

Таблица 1

Удлинение стержней волос при указанной обработке (n = 60).

3,4 6-гингерол задерживает индукцию анагена из телогена у мышей

Приведенные выше результаты показывают только влияние 6-гингерола на культивированные DPC и волосяные фолликулы in vitro , что не так же, как и ситуация на месте. Чтобы преодолеть это ограничение, мы оценили роль 6-гингерола в росте волос in vivo с использованием мышей C57BL / 6 в возрасте 8 недель. Когда волосяные фолликулы дорсальной шерсти находились в фазе телогена, мышей брили на спине и выбирали тех, у которых была однородная кожа на стадии телогена.Кожу спины обрабатывали только носителем (контроль) или 6-гингеролом каждый день в течение 10 дней. показывает возобновление роста волос с 5-дневными интервалами для контроля и для лечения 6-гингеролом (например, 1 мг / мл 6-гингерола). У нормальных контрольных мышей наблюдали слабый рост волос через 10 дней после депиляции. Стало очевидно, что шерсть у мышей полностью отросла до исходного состояния в течение ~ 20 дней. После местного применения 6-гингерола в концентрации 1 мг / мл, слабый рост волос наблюдался через 15 дней после депиляции, а редкий рост волос наблюдался через 20 дней после депиляции.Влияние 6-гингерола на плотность волосяных фолликулов дополнительно оценивали путем окрашивания H&E. Соответственно, местное применение 6-гингерола может значительно уменьшить количество волосяных фолликулов по сравнению с контрольной группой ().

После депиляции кожу спины обрабатывали носителем (справа) или 6-гингеролом в концентрации 1 мг / мл (слева) каждый день в течение 10 дней. Фотографии каждого животного делались каждые 5 дней.По сравнению с контролем, обработанным носителем, 6-гингерол в дозе 1 мг / мл может значительно ингибировать индукцию анагена телогеном. (A) нулевой день, (B) 5 дней, (C) 10 дней, (D) 15 дней и (E) 20 дней после депиляции. (F) Увеличенная фотография левой мыши в (E).

После депиляции спины кожу обрабатывали только носителем (контроль) или 1 мг / мл 6-гингерола каждый день в течение 10 дней. Действие 6-гингерола на волосяные фолликулы анализировали с помощью окрашивания H&E через 20 дней после депиляции.(а) — (в) Продольные срезы спинной кожи. (б) — (г) Поперечные срезы спинной кожи. Каждая шкала соответствует 200 мкм.

Обсуждение

Имбирь ( Z. officinale ) традиционно использовался в Восточной Азии для предотвращения выпадения волос и стимуляции роста волос. В настоящее время несколько компаний производят шампуни, содержащие экстракт имбиря, и заявляют, что он обладает эффектом против выпадения и роста волос [9], [10]; однако нет убедительных доказательств, подтверждающих заявленное влияние имбиря на рост волос.В этом исследовании было обнаружено, что 6-гингерол, основной активный компонент имбиря, значительно подавляет рост волос как in vitro , так и in vivo . Насколько нам известно, настоящее исследование является первым, в котором оценивается влияние 6-гингерола на рост волос. Наши результаты показывают, что 6-гингерол не способствует росту волос и может подавлять рост волос, вызывая апоптотические эффекты на DPC (уменьшая соотношение Bcl-2 / Bax).

Мы обнаружили, что 6-гингерол в диапазоне концентраций 5–10 мкг / мл вызывает значительное дозозависимое ингибирование пролиферации человеческих DPC ex vivo.Более того, 20 мкг / мл 6-гингерола значительно подавляли удлинение стержня волоса (1,06 ± 0,21 мм) по сравнению с контрольной группой (1,48 ± 0,20 мм).

Было показано, что 6-гингерол индуцирует апоптоз в основном за счет стимуляции митохондриального (внутреннего) пути гибели [20] — [22], который регулируется в основном белками семейства Bcl-2, в частности проапоптотическим Bax и антиапоптотическим Белки Bcl-2 [23], [24]. Принято считать, что Bcl-2 защищает клетки от апоптоза и что активность Bcl-2 определяется взаимодействием с Bax [25].Интересно, что Bcl-2 и Bax, как было показано, регулируют апоптоз волосяных фолликулов во время фазы регрессии цикла волос, вызванной апоптозом (катаген) [26], [27]. Эти данные привели к гипотезе о том, что 6-гингерол индуцирует апоптоз в клетках волосяных фолликулов, регулируя уровни Bcl-2 и Bax. В этом исследовании мы показали, что 6-гингерол влияет на экспрессию Bcl-2 и Bax в культивируемых человеческих DPC. Мы обнаружили, что 6-гингерол увеличивает Bax и снижает экспрессию Bcl-2 в культивируемых DPC. Обработка 6-гингеролом в течение 48 часов индуцировала значительное увеличение экспрессии Bax и снижение экспрессии Bcl-2 по сравнению с контрольной группой.Кроме того, белок Bax был активирован в зависимости от дозы 6-гингерола. На основании результатов этого и более ранних исследований [4], [12], [13], [26], [27] мы предполагаем, что 6-гингерол вызывает апоптоз в DPC, снижая уровень Bcl-2 и повышение уровня Bax.

Мы подтвердили, что 6-гингерол подавляет удлинение стержня волоса ex vivo, вызывая апоптотическое повреждение в DPC, но неясно, может ли 6-гингерол проникать в волосяные фолликулы и вызывать апоптотическое повреждение в DPC in vivo .По сравнению с ситуацией ex vivo, DPC в волосяных фолликулах in situ обладают более высокой устойчивостью к факторам повреждения [28]; Таким образом, чтобы определить, произошли ли наблюдаемые ex vivo изменения in vivo , мы исследовали ингибирующую рост волос активность 6-гингерола на 8-недельных мышах C57BL / 6 в стабильной и последовательной фазе телогена [19]. На выбритую кожу спины мышей C57BL / 6 ежедневно наносили местно 6-гингерол в течение 10 дней. У нормальных контрольных мышей слабый рост волос наблюдался через 10 дней, а полный рост наблюдался через 20 дней после депиляции.Однако в группе, получавшей 1 мг / мл 6-гингерола, через 15 дней наблюдалось только слабое отрастание волос, а через 20 дней после депиляции — редкое отрастание. Для дальнейшего изучения ингибирования роста волос мы оценили влияние 6-гингерола на плотность волосяных фолликулов путем окрашивания (H&E). Соответственно, местное применение 6-гингерола в концентрации 1 мг / мл может существенно уменьшить количество волосяных фолликулов по сравнению с контрольной группой. Таким образом, было подтверждено, что первоначально наблюдаемые события in vitro фактически произошли in vivo .

Нежелательные волосы на теле могут быть эмоционально и социально разрушительными [29], что требует поиска различных методов лечения. Самый простой и популярный метод — это использование средств для депиляции, которые химически удаляют волосы с поверхности кожи, растворяя кератин, но имеют только временный эффект. К сожалению, есть некоторые побочные эффекты, такие как кожная аллергия, парадоксальный гипертрихоз или ожог кожи [30]. Согласно результатам настоящего исследования, 6-гингерол может снижать плотность волосяных фолликулов, вызывая апоптотические эффекты на DPC, и является потенциальным лекарством для стойкого удаления волос.

Таким образом, мы впервые сообщаем, что 6-гингерол не влияет на стимуляцию роста волос, напротив, может подавлять рост человеческих волос за счет своего ингибирующего и проапоптотического действия на DPC in vitro и вызывать пролонгирование фазы телогена in vivo . Таким образом, 6-гингерол является скорее лекарством, не стимулирующим рост волос, а потенциальным лекарственным средством, подавляющим рост волос; т.е. для удаления волос. Недостатки этого исследования заключаются в том, что в нем было немного меньше случаев, неизвестный эффект 6-гингерола на фолликулярные эпителиальные клетки и генетические изменения 6-гингерола на клетки сосочков дермы in vivo .Поэтому в будущих экспериментах, помимо увеличения размера выборки, мы должны проводить дальнейшие эксперименты для решения вышеупомянутых проблем.

Благодарности

Авторы благодарят Shengqi Wang, Boxin Zhao, Jindou Jiang, Zhehua Li и Zhidan Zhang за их техническую поддержку и критические обсуждения.

Отчет о финансировании

Эта работа была поддержана Китайским фондом естественных наук (грант № 31170949). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Список литературы

6-Гингерол подавляет рост стержня волос в культивируемых фолликулах волос человека и модулирует рост волос у мышей

PLoS One. 2013; 8 (2): e57226.

Юн Мяо

¹ Отделение пластической и эстетической хирургии, больница Нанфанг, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

Ябин Сан

² Офис GCP, Больница Нанфанг, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

Вэньцзюнь Ван

³ Институт исследования рака, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

Benjun Du

¹ Отделение пластической и эстетической хирургии, больница Нанфанг, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

Шун-э Сяо

¹ Отделение пластической и эстетической хирургии, больница Нанфанг, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

Ицзюэ Ху

¹ Отделение пластической и эстетической хирургии, больница Нанфанг, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

Чжици Ху

¹ Отделение пластической и эстетической хирургии, больница Нанфанг, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

Майкл Хэмблин, редактор

¹ Отделение пластической и эстетической хирургии, больница Нанфанг, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

² Офис GCP, Больница Нанфанг, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

³ Институт исследования рака, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

MGH, MMS, Соединенные Штаты Америки,

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Задумал и спроектировал эксперименты: ZH YM. Проведены эксперименты: YM YS SX. Проанализированы данные: WW BD. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: YH YS. Написал статью: Ю.М.

Поступила 28 июля 2012 г .; Принято 18 января 2013 г.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии надлежащего указания автора и источника.

Abstract

Имбирь ( Zingiber officinale ) традиционно используется для сдерживания выпадения и стимуляции роста волос в Восточной Азии. Несколько компаний производят шампунь, содержащий экстракт имбиря, который, как утверждается, обладает свойствами против выпадения и стимулирования роста волос. Однако нет никаких научных доказательств, подтверждающих эти утверждения. Это исследование было предпринято для измерения 6-гингерола, основного активного компонента имбиря, на удлинение стержня волоса in vitro и рост волос in vivo , а также для изучения его влияния на клетки дермального сосочка человека (DPC) in vivo и in vitro. 6-Гингерол подавлял рост волос в волосяных фолликулах в культуре и пролиферацию культивированных DPC. Ингибирование роста DPC 6-гингеролом in vitro может отражать снижение отношения Bcl-2 / Bax. Аналогичные результаты были получены in vivo . Результаты этого исследования показали, что 6-гингерол не обладает способностью стимулировать рост волос, напротив, может подавлять рост человеческих волос за счет своего ингибирующего и проапоптотического воздействия на DPC in vitro и может вызывать удлинение телогена. фаза in vivo .Таким образом, 6-гингерол является скорее лекарством, не стимулирующим рост волос, а потенциальным лекарственным средством, подавляющим рост волос; т.е. для удаления волос.

Введение

Волосяной фолликул млекопитающих содержит дермальный сосочек (DP), который в основном состоит из DP-клеток (DPC), и дермальную оболочку, происходящую из мезенхимы, а также эпителиальные клетки наружной корневой оболочки, внутренней корневой оболочки, матрицы и стержня волоса происходит из эпителия [11].Постнатальный волосяной фолликул проходит цикл анагена (фаза роста), катагена (фаза регресса) и телогена (фаза покоя). Взаимные взаимодействия между эпителием и мезенхимой важны для послеродового роста волос и цикличности волосяных фолликулов. DP, как известно, играет ключевую роль в регуляции роста волос и цикличности [11]. Таким образом, любой фактор, который влияет на функции DPC, может влиять на рост волос. Например, миноксидил [12] и эпигаллокатехин-3-галлат [4] стимулируют рост волос, оказывая свое антиапоптотическое действие на DPC (за счет увеличения соотношения Bcl-2 / Bax), это один из механизмов воздействия на Миноксидил.С другой стороны, цисплатин [13] приводит к выпадению волос, вызывая апоптотические эффекты на DPC (за счет уменьшения отношения Bcl-2 / Bax).

В последнее время было проведено несколько научных исследований, направленных на выделение и идентификацию активных компонентов имбиря, а также на научную проверку его фармакологического действия и действия его составляющих [14], [15]. Результаты показывают, что 6-гингерол является наиболее распространенным активным компонентом и обладает различными фармакологическими и микробиологическими эффектами, включая противоопухолевое, противовоспалительное, антиоксидантное и противорвотное действие; Однако фармакологические эффекты 6-гингерола на рост волос научно не доказаны.

В этом исследовании мы исследовали эффекты 6-гингерола на человеческие DPC и рост волосяного стержня ex vivo и рост волос у мышей.

Материалы и методы

2.1. Выделение и культивирование волосяных фолликулов человека

Образцы пункционной биопсии (4 мм) были взяты с неболедых затылочных костей головы пациентов, перенесших операцию по трансплантации волос по поводу андрогенной алопеции. Медицинский этический комитет Южного медицинского университета одобрил все исследования, описанные здесь.Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией принципов, и от всех пациентов было получено информированное письменное согласие. Волосяные фолликулы выделяли и культивировали, как описано Philpott et al [16]. Вкратце, волосяные фолликулы выделяли щипцами под бинокулярным световым микроскопом и культивировали в 24-луночных чашках в течение 7 дней в среде Williams E (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) с добавлением 10 нг / мл гидрокортизона, 10 мг / мл инсулина 2. мМ L-глутамин, 100 Ед / мл стрептомицина и 10 нг / мл гидрокортизона при 37 ° C в атмосфере 5% (об. / об.) CO ₂ .6-Гингерол (чистота> 95%; Sigma Chemical Co., Сент-Луис, Миссури) растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО; Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Пекин, Китай) и для сохранения конечной концентрации носителя < 0,1%. 6-Гингерол добавляли в культуральную среду в концентрации 10 или 20 мкг / мл, и 0,1% (об. / Об.) ДМСО использовали в качестве контроля. Во всех экспериментах культуральную среду и 6-гингерол обновляли через день. Всего 180 анагенных волосяных фолликулов от 3 разных добровольцев (60 фолликулов / субъект) культивировали при каждом условии роста.Средняя длина волосяного фолликула от дна дермальных сосочков в нулевой день составляла 4,5 мм.

2.2. Культура человеческих DPC

DPC выделяли и культивировали, как описано Magerl et al [17]. Вкратце, кожные сосочки были микродиссектированы с луковиц рассеченных волосяных фолликулов, перенесены на пластиковые чашки и культивированы в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM; Gibco, Grand Island, NY) с добавлением 100 Ед / мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицина и 20 мг / мл. % (об. / об.) фетальной бычьей сыворотки (FBS; Gibco) при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO ₂ .Эксплантаты выдерживали в среде в течение 7 дней, среду меняли каждые 3 дня. Когда рост клеток становился субконфлюэнтным, клетки собирали с 0,25% (мас. / Об.) Трипсин-ЭДТА (Invitrogen, Carlsbad, CA) и субкультивировали с соотношением деления 1: 3. После этого DPC поддерживали в DMEM с добавлением 10% FBS.

2.3 Анализы пролиферации клеток и апоптоза

Пролиферацию клеток определяли с помощью анализа МТТ, как описано Мосманном [18]. Вкратце, DPC (3 × 10 ⁴ клеток / лунку) высевали в 96-луночные планшеты и инкубировали в течение 24 часов перед добавлением 6-гингерола в концентрации 5 или 10 мкг / мл, а затем инкубировали при 37 ° C в течение 48 часов, используя 0.1% ДМСО в качестве отрицательного контроля. Поглощение при 490 нм измеряли с использованием ридера для ELISA. Относительную жизнеспособность клеток рассчитывали путем деления оптической плотности обработанных клеток на оптическую плотность необработанных клеток в каждом эксперименте.

DPC, высеянные в 6-луночные планшеты с плотностью 2,5 × 10 ⁵ клеток / лунку обрабатывали 5 или 10 мкг / мл 6-гингерола или 0,1% ДМСО в качестве контроля в течение 48 часов. Апоптоз клеток исследовали с использованием набора для обнаружения аннексина V (Caltag-Medsystems Ltd., Buckingham, UK) в соответствии с инструкциями производителя.Сбор и анализ данных проводились на цитометре FACSort (FAC-SCA, New York, NY). Минимум 2,5 × 10 ⁵ событий клеток было получено для каждой группы в процессе анализа, и каждый эксперимент повторяли не менее 3 раз.

2.4 Вестерн-блоттинг

И контрольные, и обработанные 6-гингеролом DPC собирали через 48 часов после обработки. Готовили полные клеточные лизаты и 30 мкг белка подвергали электрофорезу в додецилсульфате натрия / полиакриламидном геле (SDS-PAGE) с последующим иммуноблот-анализом.Первичные антитела инкубировали при соответствующих разведениях: моноклональное антитело против Bcl-2, 1: 500; моноклональное антитело против Bax, 1: 500; и моноклональное антитело против GAPDH, 1: 1000 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Санта-Крус, Калифорния). Иммунные комплексы детектировали с использованием набора для вестерн-блоттинга с усиленной хемилюминесценцией (ECL) (Santa Cruz) и количественно определяли с использованием программного обеспечения для денситометрии аналитик / ПК (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

2.5 Анализ 6-гингерола in vivo

Всего 36 самок мышей C57BL / 6 (возраст 8 недель) были приобретены в Центре экспериментальных животных Южного медицинского университета (Гуанчжоу, Китай) и случайным образом разделены на 3 группы (12 /группа).Анаген был индуцирован депиляцией кожи на спине мышей C57BL / 6, которые находились в фазе телогена цикла, как описано [19]. Вкратце, волосы удаляли путем местного применения тиогликолата кальция. Со следующего дня (день 1) 0,2 мл 0,1 мг / мл или 1 мг / мл 6-гингерола в 75% (об. / Об.) Этаноле наносили на кожу спины каждого животного каждый день в течение 10 дней. Контрольные животные получали только раствор носителя. Каждые 5 дней после депиляции за спиной каждой мыши наблюдали и фотографировали.Все эксперименты длились 20 дней, после чего мышей умерщвляли. Гистологию образцов кожи, взятых со спины каждой мыши, исследовали с помощью окрашивания гематоксилином и эозином (H&E). Все экспериментальные манипуляции проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения и с одобрения Комитета по этике экспериментальных животных Южного медицинского университета.

2.6 Статистический анализ

Все данные выражены как среднее ± стандартное отклонение от трех независимых экспериментов.Весь статистический анализ проводился с помощью SPSS 13.0. Различия между экспериментальными группами оценивали с помощью теста Стьюдента t . Статистически значимая разница была установлена ​​на уровне P <0,05.

Результаты

3.1 6-гингерол значительно подавляет рост DPC и индуцирует апоптоз клеток

Чтобы изучить влияние 6-гингерола на пролиферацию DPC, мы обрабатывали DPC ДМСО (контроль) или 6-гингеролом (5 или 10 мкг / мл). В течение 48 часов культивирования 6-гингерол проявлял значительный дозозависимый ингибирующий эффект на DPC ().Чтобы определить механизмы, лежащие в основе роста ингибированных 6-гингеролом DPC, влияние 6-гингерола на апоптоз клеток оценивали путем окрашивания флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) и аннексином V. Соответственно, воздействие 6-гингерола на DPC значительно увеличивало апоптоз клеток. по сравнению с контрольной группой, что позволяет предположить, что апоптоз является механизмом, лежащим в основе цитотоксичности, вызванной 6-гингеролом ().

DPC культивировали с различными концентрациями 6-гингерола в течение 48 часов. По сравнению с контролем, обработанным носителем, обработка 10 мкг / мл 6-гингерола значительно ингибировала пролиферацию клеток. (А) Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа МТТ. * P <0,05 по сравнению с контролем, обработанным носителем. (B) Анализ клеток на апоптоз.

3.2 Влияние лечения 6-гингеролом на регуляторные белки апоптоза

Ранее было показано, что 6-гингерол вызывает апоптоз через путь гибели митохондрий [20] — [22].Поскольку известно, что этот путь апоптоза регулируется балансом анти- и проапоптотических белков семейства Bcl-2 [23], [24], мы исследовали уровень экспрессии двух ключевых белков семейства Bcl-2 Bcl. -2 и Bax в ответ на обработку DPC 6-гингеролом. Исследования иммуноблоттинга показывают, что 6-гингерол индуцировал значительное подавление антиапоптотического белка Bcl-2 и повышение проапоптотического белка Bax по сравнению с контролем, обработанным носителем. Кроме того, уровень белка Bax был повышен дозозависимым образом от 6-гингерола ( P <0.05) ().

(A) DPC обрабатывали указанными концентрациями 6-гингерола (0,1% ДМСО контроль) в течение 48 часов и подвергали вестерн-блоттингу. Показаны репрезентативные полосы. (B) Гистограммы, показывающие количественную оценку полос вестерн-блоттинга. GAPDH использовался в качестве внутреннего контроля. * P <0,05 по сравнению с контрольной (0,1% ДМСО) группой.

3,3 6-гингерол подавляет удлинение стержня волоса в культивируемых волосяных фолликулах человека

Поскольку DP играет ключевую роль в регуляции роста волос, мы исследовали влияние 6-гингерола на удлинение стержня волоса.Волосяные фолликулы кожи головы человека выделяли и культивировали как в отсутствие, так и в присутствии 6-гингерола. Мы наблюдали, что 20 мкг / мл 6-гингерола значительно подавляют удлинение стержней волос (и).

Волосяные фолликулы обрабатывали 6-гингеролом в различных концентрациях в течение 7 дней, а удлинение стержней человеческих волос измеряли с помощью калиброванной сетки окуляра в световом микроскопе при увеличении 20 ×.(n = 60)

Таблица 1

Удлинение стержней волос при указанной обработке (n = 60).

3,4 6-гингерол задерживает индукцию анагена из телогена у мышей

Приведенные выше результаты показывают только влияние 6-гингерола на культивированные DPC и волосяные фолликулы in vitro , что не так же, как и ситуация на месте. Чтобы преодолеть это ограничение, мы оценили роль 6-гингерола в росте волос in vivo с использованием мышей C57BL / 6 в возрасте 8 недель. Когда волосяные фолликулы дорсальной шерсти находились в фазе телогена, мышей брили на спине и выбирали тех, у которых была однородная кожа на стадии телогена.Кожу спины обрабатывали только носителем (контроль) или 6-гингеролом каждый день в течение 10 дней. показывает возобновление роста волос с 5-дневными интервалами для контроля и для лечения 6-гингеролом (например, 1 мг / мл 6-гингерола). У нормальных контрольных мышей наблюдали слабый рост волос через 10 дней после депиляции. Стало очевидно, что шерсть у мышей полностью отросла до исходного состояния в течение ~ 20 дней. После местного применения 6-гингерола в концентрации 1 мг / мл, слабый рост волос наблюдался через 15 дней после депиляции, а редкий рост волос наблюдался через 20 дней после депиляции.Влияние 6-гингерола на плотность волосяных фолликулов дополнительно оценивали путем окрашивания H&E. Соответственно, местное применение 6-гингерола может значительно уменьшить количество волосяных фолликулов по сравнению с контрольной группой ().

После депиляции кожу спины обрабатывали носителем (справа) или 6-гингеролом в концентрации 1 мг / мл (слева) каждый день в течение 10 дней. Фотографии каждого животного делались каждые 5 дней.По сравнению с контролем, обработанным носителем, 6-гингерол в дозе 1 мг / мл может значительно ингибировать индукцию анагена телогеном. (A) нулевой день, (B) 5 дней, (C) 10 дней, (D) 15 дней и (E) 20 дней после депиляции. (F) Увеличенная фотография левой мыши в (E).

После депиляции спины кожу обрабатывали только носителем (контроль) или 1 мг / мл 6-гингерола каждый день в течение 10 дней. Действие 6-гингерола на волосяные фолликулы анализировали с помощью окрашивания H&E через 20 дней после депиляции.(а) — (в) Продольные срезы спинной кожи. (б) — (г) Поперечные срезы спинной кожи. Каждая шкала соответствует 200 мкм.

Обсуждение

Имбирь ( Z. officinale ) традиционно использовался в Восточной Азии для предотвращения выпадения волос и стимуляции роста волос. В настоящее время несколько компаний производят шампуни, содержащие экстракт имбиря, и заявляют, что он обладает эффектом против выпадения и роста волос [9], [10]; однако нет убедительных доказательств, подтверждающих заявленное влияние имбиря на рост волос.В этом исследовании было обнаружено, что 6-гингерол, основной активный компонент имбиря, значительно подавляет рост волос как in vitro , так и in vivo . Насколько нам известно, настоящее исследование является первым, в котором оценивается влияние 6-гингерола на рост волос. Наши результаты показывают, что 6-гингерол не способствует росту волос и может подавлять рост волос, вызывая апоптотические эффекты на DPC (уменьшая соотношение Bcl-2 / Bax).

Мы обнаружили, что 6-гингерол в диапазоне концентраций 5–10 мкг / мл вызывает значительное дозозависимое ингибирование пролиферации человеческих DPC ex vivo.Более того, 20 мкг / мл 6-гингерола значительно подавляли удлинение стержня волоса (1,06 ± 0,21 мм) по сравнению с контрольной группой (1,48 ± 0,20 мм).

Было показано, что 6-гингерол индуцирует апоптоз в основном за счет стимуляции митохондриального (внутреннего) пути гибели [20] — [22], который регулируется в основном белками семейства Bcl-2, в частности проапоптотическим Bax и антиапоптотическим Белки Bcl-2 [23], [24]. Принято считать, что Bcl-2 защищает клетки от апоптоза и что активность Bcl-2 определяется взаимодействием с Bax [25].Интересно, что Bcl-2 и Bax, как было показано, регулируют апоптоз волосяных фолликулов во время фазы регрессии цикла волос, вызванной апоптозом (катаген) [26], [27]. Эти данные привели к гипотезе о том, что 6-гингерол индуцирует апоптоз в клетках волосяных фолликулов, регулируя уровни Bcl-2 и Bax. В этом исследовании мы показали, что 6-гингерол влияет на экспрессию Bcl-2 и Bax в культивируемых человеческих DPC. Мы обнаружили, что 6-гингерол увеличивает Bax и снижает экспрессию Bcl-2 в культивируемых DPC. Обработка 6-гингеролом в течение 48 часов индуцировала значительное увеличение экспрессии Bax и снижение экспрессии Bcl-2 по сравнению с контрольной группой.Кроме того, белок Bax был активирован в зависимости от дозы 6-гингерола. На основании результатов этого и более ранних исследований [4], [12], [13], [26], [27] мы предполагаем, что 6-гингерол вызывает апоптоз в DPC, снижая уровень Bcl-2 и повышение уровня Bax.

Мы подтвердили, что 6-гингерол подавляет удлинение стержня волоса ex vivo, вызывая апоптотическое повреждение в DPC, но неясно, может ли 6-гингерол проникать в волосяные фолликулы и вызывать апоптотическое повреждение в DPC in vivo .По сравнению с ситуацией ex vivo, DPC в волосяных фолликулах in situ обладают более высокой устойчивостью к факторам повреждения [28]; Таким образом, чтобы определить, произошли ли наблюдаемые ex vivo изменения in vivo , мы исследовали ингибирующую рост волос активность 6-гингерола на 8-недельных мышах C57BL / 6 в стабильной и последовательной фазе телогена [19]. На выбритую кожу спины мышей C57BL / 6 ежедневно наносили местно 6-гингерол в течение 10 дней. У нормальных контрольных мышей слабый рост волос наблюдался через 10 дней, а полный рост наблюдался через 20 дней после депиляции.Однако в группе, получавшей 1 мг / мл 6-гингерола, через 15 дней наблюдалось только слабое отрастание волос, а через 20 дней после депиляции — редкое отрастание. Для дальнейшего изучения ингибирования роста волос мы оценили влияние 6-гингерола на плотность волосяных фолликулов путем окрашивания (H&E). Соответственно, местное применение 6-гингерола в концентрации 1 мг / мл может существенно уменьшить количество волосяных фолликулов по сравнению с контрольной группой. Таким образом, было подтверждено, что первоначально наблюдаемые события in vitro фактически произошли in vivo .

Нежелательные волосы на теле могут быть эмоционально и социально разрушительными [29], что требует поиска различных методов лечения. Самый простой и популярный метод — это использование средств для депиляции, которые химически удаляют волосы с поверхности кожи, растворяя кератин, но имеют только временный эффект. К сожалению, есть некоторые побочные эффекты, такие как кожная аллергия, парадоксальный гипертрихоз или ожог кожи [30]. Согласно результатам настоящего исследования, 6-гингерол может снижать плотность волосяных фолликулов, вызывая апоптотические эффекты на DPC, и является потенциальным лекарством для стойкого удаления волос.

Таким образом, мы впервые сообщаем, что 6-гингерол не влияет на стимуляцию роста волос, напротив, может подавлять рост человеческих волос за счет своего ингибирующего и проапоптотического действия на DPC in vitro и вызывать пролонгирование фазы телогена in vivo . Таким образом, 6-гингерол является скорее лекарством, не стимулирующим рост волос, а потенциальным лекарственным средством, подавляющим рост волос; т.е. для удаления волос. Недостатки этого исследования заключаются в том, что в нем было немного меньше случаев, неизвестный эффект 6-гингерола на фолликулярные эпителиальные клетки и генетические изменения 6-гингерола на клетки сосочков дермы in vivo .Поэтому в будущих экспериментах, помимо увеличения размера выборки, мы должны проводить дальнейшие эксперименты для решения вышеупомянутых проблем.

Благодарности

Авторы благодарят Shengqi Wang, Boxin Zhao, Jindou Jiang, Zhehua Li и Zhidan Zhang за их техническую поддержку и критические обсуждения.

Отчет о финансировании

Эта работа была поддержана Китайским фондом естественных наук (грант № 31170949). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Список литературы

6-Гингерол подавляет рост стержня волос в культивируемых фолликулах волос человека и модулирует рост волос у мышей

PLoS One. 2013; 8 (2): e57226.

Юн Мяо

¹ Отделение пластической и эстетической хирургии, больница Нанфанг, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

Ябин Сан

² Офис GCP, Больница Нанфанг, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

Вэньцзюнь Ван

³ Институт исследования рака, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

Benjun Du

¹ Отделение пластической и эстетической хирургии, больница Нанфанг, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

Шун-э Сяо

¹ Отделение пластической и эстетической хирургии, больница Нанфанг, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

Ицзюэ Ху

¹ Отделение пластической и эстетической хирургии, больница Нанфанг, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

Чжици Ху

¹ Отделение пластической и эстетической хирургии, больница Нанфанг, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

Майкл Хэмблин, редактор

¹ Отделение пластической и эстетической хирургии, больница Нанфанг, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

² Офис GCP, Больница Нанфанг, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

³ Институт исследования рака, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Гуандун, Китай,

MGH, MMS, Соединенные Штаты Америки,

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Задумал и спроектировал эксперименты: ZH YM. Проведены эксперименты: YM YS SX. Проанализированы данные: WW BD. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: YH YS. Написал статью: Ю.М.

Поступила 28 июля 2012 г .; Принято 18 января 2013 г.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии надлежащего указания автора и источника.

Abstract

Имбирь ( Zingiber officinale ) традиционно используется для сдерживания выпадения и стимуляции роста волос в Восточной Азии. Несколько компаний производят шампунь, содержащий экстракт имбиря, который, как утверждается, обладает свойствами против выпадения и стимулирования роста волос. Однако нет никаких научных доказательств, подтверждающих эти утверждения. Это исследование было предпринято для измерения 6-гингерола, основного активного компонента имбиря, на удлинение стержня волоса in vitro и рост волос in vivo , а также для изучения его влияния на клетки дермального сосочка человека (DPC) in vivo и in vitro. 6-Гингерол подавлял рост волос в волосяных фолликулах в культуре и пролиферацию культивированных DPC. Ингибирование роста DPC 6-гингеролом in vitro может отражать снижение отношения Bcl-2 / Bax. Аналогичные результаты были получены in vivo . Результаты этого исследования показали, что 6-гингерол не обладает способностью стимулировать рост волос, напротив, может подавлять рост человеческих волос за счет своего ингибирующего и проапоптотического воздействия на DPC in vitro и может вызывать удлинение телогена. фаза in vivo .Таким образом, 6-гингерол является скорее лекарством, не стимулирующим рост волос, а потенциальным лекарственным средством, подавляющим рост волос; т.е. для удаления волос.

Введение

Волосяной фолликул млекопитающих содержит дермальный сосочек (DP), который в основном состоит из DP-клеток (DPC), и дермальную оболочку, происходящую из мезенхимы, а также эпителиальные клетки наружной корневой оболочки, внутренней корневой оболочки, матрицы и стержня волоса происходит из эпителия [11].Постнатальный волосяной фолликул проходит цикл анагена (фаза роста), катагена (фаза регресса) и телогена (фаза покоя). Взаимные взаимодействия между эпителием и мезенхимой важны для послеродового роста волос и цикличности волосяных фолликулов. DP, как известно, играет ключевую роль в регуляции роста волос и цикличности [11]. Таким образом, любой фактор, который влияет на функции DPC, может влиять на рост волос. Например, миноксидил [12] и эпигаллокатехин-3-галлат [4] стимулируют рост волос, оказывая свое антиапоптотическое действие на DPC (за счет увеличения соотношения Bcl-2 / Bax), это один из механизмов воздействия на Миноксидил.С другой стороны, цисплатин [13] приводит к выпадению волос, вызывая апоптотические эффекты на DPC (за счет уменьшения отношения Bcl-2 / Bax).

В последнее время было проведено несколько научных исследований, направленных на выделение и идентификацию активных компонентов имбиря, а также на научную проверку его фармакологического действия и действия его составляющих [14], [15]. Результаты показывают, что 6-гингерол является наиболее распространенным активным компонентом и обладает различными фармакологическими и микробиологическими эффектами, включая противоопухолевое, противовоспалительное, антиоксидантное и противорвотное действие; Однако фармакологические эффекты 6-гингерола на рост волос научно не доказаны.

В этом исследовании мы исследовали эффекты 6-гингерола на человеческие DPC и рост волосяного стержня ex vivo и рост волос у мышей.

Материалы и методы

2.1. Выделение и культивирование волосяных фолликулов человека

Образцы пункционной биопсии (4 мм) были взяты с неболедых затылочных костей головы пациентов, перенесших операцию по трансплантации волос по поводу андрогенной алопеции. Медицинский этический комитет Южного медицинского университета одобрил все исследования, описанные здесь.Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией принципов, и от всех пациентов было получено информированное письменное согласие. Волосяные фолликулы выделяли и культивировали, как описано Philpott et al [16]. Вкратце, волосяные фолликулы выделяли щипцами под бинокулярным световым микроскопом и культивировали в 24-луночных чашках в течение 7 дней в среде Williams E (Gibco BRL, Gaithersburg, MD) с добавлением 10 нг / мл гидрокортизона, 10 мг / мл инсулина 2. мМ L-глутамин, 100 Ед / мл стрептомицина и 10 нг / мл гидрокортизона при 37 ° C в атмосфере 5% (об. / об.) CO ₂ .6-Гингерол (чистота> 95%; Sigma Chemical Co., Сент-Луис, Миссури) растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО; Solarbio Science & Technology Co., Ltd., Пекин, Китай) и для сохранения конечной концентрации носителя < 0,1%. 6-Гингерол добавляли в культуральную среду в концентрации 10 или 20 мкг / мл, и 0,1% (об. / Об.) ДМСО использовали в качестве контроля. Во всех экспериментах культуральную среду и 6-гингерол обновляли через день. Всего 180 анагенных волосяных фолликулов от 3 разных добровольцев (60 фолликулов / субъект) культивировали при каждом условии роста.Средняя длина волосяного фолликула от дна дермальных сосочков в нулевой день составляла 4,5 мм.

2.2. Культура человеческих DPC

DPC выделяли и культивировали, как описано Magerl et al [17]. Вкратце, кожные сосочки были микродиссектированы с луковиц рассеченных волосяных фолликулов, перенесены на пластиковые чашки и культивированы в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM; Gibco, Grand Island, NY) с добавлением 100 Ед / мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицина и 20 мг / мл. % (об. / об.) фетальной бычьей сыворотки (FBS; Gibco) при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO ₂ .Эксплантаты выдерживали в среде в течение 7 дней, среду меняли каждые 3 дня. Когда рост клеток становился субконфлюэнтным, клетки собирали с 0,25% (мас. / Об.) Трипсин-ЭДТА (Invitrogen, Carlsbad, CA) и субкультивировали с соотношением деления 1: 3. После этого DPC поддерживали в DMEM с добавлением 10% FBS.

2.3 Анализы пролиферации клеток и апоптоза

Пролиферацию клеток определяли с помощью анализа МТТ, как описано Мосманном [18]. Вкратце, DPC (3 × 10 ⁴ клеток / лунку) высевали в 96-луночные планшеты и инкубировали в течение 24 часов перед добавлением 6-гингерола в концентрации 5 или 10 мкг / мл, а затем инкубировали при 37 ° C в течение 48 часов, используя 0.1% ДМСО в качестве отрицательного контроля. Поглощение при 490 нм измеряли с использованием ридера для ELISA. Относительную жизнеспособность клеток рассчитывали путем деления оптической плотности обработанных клеток на оптическую плотность необработанных клеток в каждом эксперименте.

DPC, высеянные в 6-луночные планшеты с плотностью 2,5 × 10 ⁵ клеток / лунку обрабатывали 5 или 10 мкг / мл 6-гингерола или 0,1% ДМСО в качестве контроля в течение 48 часов. Апоптоз клеток исследовали с использованием набора для обнаружения аннексина V (Caltag-Medsystems Ltd., Buckingham, UK) в соответствии с инструкциями производителя.Сбор и анализ данных проводились на цитометре FACSort (FAC-SCA, New York, NY). Минимум 2,5 × 10 ⁵ событий клеток было получено для каждой группы в процессе анализа, и каждый эксперимент повторяли не менее 3 раз.

2.4 Вестерн-блоттинг

И контрольные, и обработанные 6-гингеролом DPC собирали через 48 часов после обработки. Готовили полные клеточные лизаты и 30 мкг белка подвергали электрофорезу в додецилсульфате натрия / полиакриламидном геле (SDS-PAGE) с последующим иммуноблот-анализом.Первичные антитела инкубировали при соответствующих разведениях: моноклональное антитело против Bcl-2, 1: 500; моноклональное антитело против Bax, 1: 500; и моноклональное антитело против GAPDH, 1: 1000 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Санта-Крус, Калифорния). Иммунные комплексы детектировали с использованием набора для вестерн-блоттинга с усиленной хемилюминесценцией (ECL) (Santa Cruz) и количественно определяли с использованием программного обеспечения для денситометрии аналитик / ПК (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

2.5 Анализ 6-гингерола in vivo

Всего 36 самок мышей C57BL / 6 (возраст 8 недель) были приобретены в Центре экспериментальных животных Южного медицинского университета (Гуанчжоу, Китай) и случайным образом разделены на 3 группы (12 /группа).Анаген был индуцирован депиляцией кожи на спине мышей C57BL / 6, которые находились в фазе телогена цикла, как описано [19]. Вкратце, волосы удаляли путем местного применения тиогликолата кальция. Со следующего дня (день 1) 0,2 мл 0,1 мг / мл или 1 мг / мл 6-гингерола в 75% (об. / Об.) Этаноле наносили на кожу спины каждого животного каждый день в течение 10 дней. Контрольные животные получали только раствор носителя. Каждые 5 дней после депиляции за спиной каждой мыши наблюдали и фотографировали.Все эксперименты длились 20 дней, после чего мышей умерщвляли. Гистологию образцов кожи, взятых со спины каждой мыши, исследовали с помощью окрашивания гематоксилином и эозином (H&E). Все экспериментальные манипуляции проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения и с одобрения Комитета по этике экспериментальных животных Южного медицинского университета.

2.6 Статистический анализ

Все данные выражены как среднее ± стандартное отклонение от трех независимых экспериментов.Весь статистический анализ проводился с помощью SPSS 13.0. Различия между экспериментальными группами оценивали с помощью теста Стьюдента t . Статистически значимая разница была установлена ​​на уровне P <0,05.

Результаты

3.1 6-гингерол значительно подавляет рост DPC и индуцирует апоптоз клеток

Чтобы изучить влияние 6-гингерола на пролиферацию DPC, мы обрабатывали DPC ДМСО (контроль) или 6-гингеролом (5 или 10 мкг / мл). В течение 48 часов культивирования 6-гингерол проявлял значительный дозозависимый ингибирующий эффект на DPC ().Чтобы определить механизмы, лежащие в основе роста ингибированных 6-гингеролом DPC, влияние 6-гингерола на апоптоз клеток оценивали путем окрашивания флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) и аннексином V. Соответственно, воздействие 6-гингерола на DPC значительно увеличивало апоптоз клеток. по сравнению с контрольной группой, что позволяет предположить, что апоптоз является механизмом, лежащим в основе цитотоксичности, вызванной 6-гингеролом ().

DPC культивировали с различными концентрациями 6-гингерола в течение 48 часов. По сравнению с контролем, обработанным носителем, обработка 10 мкг / мл 6-гингерола значительно ингибировала пролиферацию клеток. (А) Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа МТТ. * P <0,05 по сравнению с контролем, обработанным носителем. (B) Анализ клеток на апоптоз.

3.2 Влияние лечения 6-гингеролом на регуляторные белки апоптоза

Ранее было показано, что 6-гингерол вызывает апоптоз через путь гибели митохондрий [20] — [22].Поскольку известно, что этот путь апоптоза регулируется балансом анти- и проапоптотических белков семейства Bcl-2 [23], [24], мы исследовали уровень экспрессии двух ключевых белков семейства Bcl-2 Bcl. -2 и Bax в ответ на обработку DPC 6-гингеролом. Исследования иммуноблоттинга показывают, что 6-гингерол индуцировал значительное подавление антиапоптотического белка Bcl-2 и повышение проапоптотического белка Bax по сравнению с контролем, обработанным носителем. Кроме того, уровень белка Bax был повышен дозозависимым образом от 6-гингерола ( P <0.05) ().

(A) DPC обрабатывали указанными концентрациями 6-гингерола (0,1% ДМСО контроль) в течение 48 часов и подвергали вестерн-блоттингу. Показаны репрезентативные полосы. (B) Гистограммы, показывающие количественную оценку полос вестерн-блоттинга. GAPDH использовался в качестве внутреннего контроля. * P <0,05 по сравнению с контрольной (0,1% ДМСО) группой.

3,3 6-гингерол подавляет удлинение стержня волоса в культивируемых волосяных фолликулах человека

Поскольку DP играет ключевую роль в регуляции роста волос, мы исследовали влияние 6-гингерола на удлинение стержня волоса.Волосяные фолликулы кожи головы человека выделяли и культивировали как в отсутствие, так и в присутствии 6-гингерола. Мы наблюдали, что 20 мкг / мл 6-гингерола значительно подавляют удлинение стержней волос (и).

Волосяные фолликулы обрабатывали 6-гингеролом в различных концентрациях в течение 7 дней, а удлинение стержней человеческих волос измеряли с помощью калиброванной сетки окуляра в световом микроскопе при увеличении 20 ×.(n = 60)

Таблица 1

Удлинение стержней волос при указанной обработке (n = 60).

3,4 6-гингерол задерживает индукцию анагена из телогена у мышей

Приведенные выше результаты показывают только влияние 6-гингерола на культивированные DPC и волосяные фолликулы in vitro , что не так же, как и ситуация на месте. Чтобы преодолеть это ограничение, мы оценили роль 6-гингерола в росте волос in vivo с использованием мышей C57BL / 6 в возрасте 8 недель. Когда волосяные фолликулы дорсальной шерсти находились в фазе телогена, мышей брили на спине и выбирали тех, у которых была однородная кожа на стадии телогена.Кожу спины обрабатывали только носителем (контроль) или 6-гингеролом каждый день в течение 10 дней. показывает возобновление роста волос с 5-дневными интервалами для контроля и для лечения 6-гингеролом (например, 1 мг / мл 6-гингерола). У нормальных контрольных мышей наблюдали слабый рост волос через 10 дней после депиляции. Стало очевидно, что шерсть у мышей полностью отросла до исходного состояния в течение ~ 20 дней. После местного применения 6-гингерола в концентрации 1 мг / мл, слабый рост волос наблюдался через 15 дней после депиляции, а редкий рост волос наблюдался через 20 дней после депиляции.Влияние 6-гингерола на плотность волосяных фолликулов дополнительно оценивали путем окрашивания H&E. Соответственно, местное применение 6-гингерола может значительно уменьшить количество волосяных фолликулов по сравнению с контрольной группой ().

После депиляции кожу спины обрабатывали носителем (справа) или 6-гингеролом в концентрации 1 мг / мл (слева) каждый день в течение 10 дней. Фотографии каждого животного делались каждые 5 дней.По сравнению с контролем, обработанным носителем, 6-гингерол в дозе 1 мг / мл может значительно ингибировать индукцию анагена телогеном. (A) нулевой день, (B) 5 дней, (C) 10 дней, (D) 15 дней и (E) 20 дней после депиляции. (F) Увеличенная фотография левой мыши в (E).

После депиляции спины кожу обрабатывали только носителем (контроль) или 1 мг / мл 6-гингерола каждый день в течение 10 дней. Действие 6-гингерола на волосяные фолликулы анализировали с помощью окрашивания H&E через 20 дней после депиляции.(а) — (в) Продольные срезы спинной кожи. (б) — (г) Поперечные срезы спинной кожи. Каждая шкала соответствует 200 мкм.

Обсуждение

Имбирь ( Z. officinale ) традиционно использовался в Восточной Азии для предотвращения выпадения волос и стимуляции роста волос. В настоящее время несколько компаний производят шампуни, содержащие экстракт имбиря, и заявляют, что он обладает эффектом против выпадения и роста волос [9], [10]; однако нет убедительных доказательств, подтверждающих заявленное влияние имбиря на рост волос.В этом исследовании было обнаружено, что 6-гингерол, основной активный компонент имбиря, значительно подавляет рост волос как in vitro , так и in vivo . Насколько нам известно, настоящее исследование является первым, в котором оценивается влияние 6-гингерола на рост волос. Наши результаты показывают, что 6-гингерол не способствует росту волос и может подавлять рост волос, вызывая апоптотические эффекты на DPC (уменьшая соотношение Bcl-2 / Bax).

Мы обнаружили, что 6-гингерол в диапазоне концентраций 5–10 мкг / мл вызывает значительное дозозависимое ингибирование пролиферации человеческих DPC ex vivo.Более того, 20 мкг / мл 6-гингерола значительно подавляли удлинение стержня волоса (1,06 ± 0,21 мм) по сравнению с контрольной группой (1,48 ± 0,20 мм).

Было показано, что 6-гингерол индуцирует апоптоз в основном за счет стимуляции митохондриального (внутреннего) пути гибели [20] — [22], который регулируется в основном белками семейства Bcl-2, в частности проапоптотическим Bax и антиапоптотическим Белки Bcl-2 [23], [24]. Принято считать, что Bcl-2 защищает клетки от апоптоза и что активность Bcl-2 определяется взаимодействием с Bax [25].Интересно, что Bcl-2 и Bax, как было показано, регулируют апоптоз волосяных фолликулов во время фазы регрессии цикла волос, вызванной апоптозом (катаген) [26], [27]. Эти данные привели к гипотезе о том, что 6-гингерол индуцирует апоптоз в клетках волосяных фолликулов, регулируя уровни Bcl-2 и Bax. В этом исследовании мы показали, что 6-гингерол влияет на экспрессию Bcl-2 и Bax в культивируемых человеческих DPC. Мы обнаружили, что 6-гингерол увеличивает Bax и снижает экспрессию Bcl-2 в культивируемых DPC. Обработка 6-гингеролом в течение 48 часов индуцировала значительное увеличение экспрессии Bax и снижение экспрессии Bcl-2 по сравнению с контрольной группой.Кроме того, белок Bax был активирован в зависимости от дозы 6-гингерола. На основании результатов этого и более ранних исследований [4], [12], [13], [26], [27] мы предполагаем, что 6-гингерол вызывает апоптоз в DPC, снижая уровень Bcl-2 и повышение уровня Bax.

Мы подтвердили, что 6-гингерол подавляет удлинение стержня волоса ex vivo, вызывая апоптотическое повреждение в DPC, но неясно, может ли 6-гингерол проникать в волосяные фолликулы и вызывать апоптотическое повреждение в DPC in vivo .По сравнению с ситуацией ex vivo, DPC в волосяных фолликулах in situ обладают более высокой устойчивостью к факторам повреждения [28]; Таким образом, чтобы определить, произошли ли наблюдаемые ex vivo изменения in vivo , мы исследовали ингибирующую рост волос активность 6-гингерола на 8-недельных мышах C57BL / 6 в стабильной и последовательной фазе телогена [19]. На выбритую кожу спины мышей C57BL / 6 ежедневно наносили местно 6-гингерол в течение 10 дней. У нормальных контрольных мышей слабый рост волос наблюдался через 10 дней, а полный рост наблюдался через 20 дней после депиляции.Однако в группе, получавшей 1 мг / мл 6-гингерола, через 15 дней наблюдалось только слабое отрастание волос, а через 20 дней после депиляции — редкое отрастание. Для дальнейшего изучения ингибирования роста волос мы оценили влияние 6-гингерола на плотность волосяных фолликулов путем окрашивания (H&E). Соответственно, местное применение 6-гингерола в концентрации 1 мг / мл может существенно уменьшить количество волосяных фолликулов по сравнению с контрольной группой. Таким образом, было подтверждено, что первоначально наблюдаемые события in vitro фактически произошли in vivo .

Нежелательные волосы на теле могут быть эмоционально и социально разрушительными [29], что требует поиска различных методов лечения. Самый простой и популярный метод — это использование средств для депиляции, которые химически удаляют волосы с поверхности кожи, растворяя кератин, но имеют только временный эффект. К сожалению, есть некоторые побочные эффекты, такие как кожная аллергия, парадоксальный гипертрихоз или ожог кожи [30]. Согласно результатам настоящего исследования, 6-гингерол может снижать плотность волосяных фолликулов, вызывая апоптотические эффекты на DPC, и является потенциальным лекарством для стойкого удаления волос.

Таким образом, мы впервые сообщаем, что 6-гингерол не влияет на стимуляцию роста волос, напротив, может подавлять рост человеческих волос за счет своего ингибирующего и проапоптотического действия на DPC in vitro и вызывать пролонгирование фазы телогена in vivo . Таким образом, 6-гингерол является скорее лекарством, не стимулирующим рост волос, а потенциальным лекарственным средством, подавляющим рост волос; т.е. для удаления волос. Недостатки этого исследования заключаются в том, что в нем было немного меньше случаев, неизвестный эффект 6-гингерола на фолликулярные эпителиальные клетки и генетические изменения 6-гингерола на клетки сосочков дермы in vivo .Поэтому в будущих экспериментах, помимо увеличения размера выборки, мы должны проводить дальнейшие эксперименты для решения вышеупомянутых проблем.

Благодарности

Авторы благодарят Shengqi Wang, Boxin Zhao, Jindou Jiang, Zhehua Li и Zhidan Zhang за их техническую поддержку и критические обсуждения.

Отчет о финансировании

Эта работа была поддержана Китайским фондом естественных наук (грант № 31170949). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Список литературы

Нанесите имбирь на кожу головы — Into The Gloss

Зрительный контакт с незнакомцем в метро — ужасное и одновременно вызывающее сожаление действие. Обычно обе стороны быстро переключают свое внимание на что-нибудь.Хотя, можно сделать исключение, когда другой наездник дает совет по красоте. При этом в моем списке мест, где можно получить совет о том, что свежий корень имбиря может творить чудеса, помогая возобновить рост волос, неудивительно, что MTA находится в конце моего списка.

Чтобы немного перемотать назад, позвольте мне сначала подтвердить, что, основываясь на личном опыте, стресс действительно может поразительным образом повлиять на все ваше тело, в том числе и на волосы. Если вы похожи на меня и позволите ему поглотить вас, у вас останется довольно большая прядь волос в центре головы, прямо там, где встречаются ваша средняя часть и челка.

Я стал очень осведомлен о своей потере волос после того, как мой давний стилист назвал ее «стрессовым пятном» во время сеанса окрашивания. Хотя мое эго успокаивало, что его не называли лысиной, это было катализатором в оценке вариантов, которые помогли бы ускорить процесс роста. После битвы с касторовым маслом (из-за его высокой плотности его трудно удалить с волос за одно мытье) и усталости от продуктов для роста волос, таких как Rogaine (не говоря уже о потенциальной стоимости), я потерпел поражение и оставил свои волосы на произвол судьбы. собственные устройства.

Имбирь, помимо того, что является восхитительным ингредиентом напитков (имбирное пиво, эль или какой-нибудь чай?), Является вундеркиндовой специей, которая помогает лечить множество проблем со здоровьем, таких как пищеварение, тошнота и воспаления. Учитывая вышесказанное и то, что у родственного духа из метро была полная голова без пятен, втирать имбирь в безволосый участок моей головы было действительно без риска.

«Имбирь содержит некоторые агенты кровообращения. Они помогают увеличить кровоток через кожу головы, что улучшает рост волосяных фолликулов », — объясняет Кэт Маркус, стилист и совладелец салона« Вербное воскресенье »в Торонто.«Свежий корень имбиря содержит магний, калий, фосфор и витамины, которые делают волосы более сильными, здоровыми и блестящими. Он также богат жирными кислотами, которые помогают предотвратить истончение волос ».

Итак, я трижды в неделю начал свой ритуал: отрезать кусок свежего корня длиной в дюйм, очистить его, натереть на терке и натереть на месте, а затем дать имбирю повиснуть там примерно на 30 минут, прежде чем смыть его. Ощущение покалывания действует как положительное подтверждение того, что на самом деле работает .

Примерно через месяц волосы, прорастающие на пятне, больше не являются 5-часовой тенью, а теперь достигают длины детского волоса. Можно с уверенностью сказать, что если мне посчастливится снова пересекаться с моим гуру по волосам MTA, я должен ей хотя бы имбирного пива.

— Эрин Лукас

Эрин Лукас — канадская писательница, живущая в Нью-Йорке. Она эксперт в селфи в масках, и есть вероятность, что если у нее есть ваш номер, вы, вероятно, получили его.

Фото ITG.Вы когда-нибудь слышали о шампуне с перцем чили? Он существует и утверждает, что волосы со временем растут.

Лечение выпадения волос: имбирь уменьшает воспаление кожи головы, что способствует росту волос.

Выпадение волос — это всего лишь часть жизни, с которой нам нужно просто бороться. Либо это? Постоянно проводятся новые исследования разнообразных продуктов, трав и масел, чтобы помочь в поисках чудодейственного средства, которое могло бы остановить процесс выпадения волос и способствовать их росту. Согласно аюрведической практике, имбирь может быть ответом.

Что такое имбирь?

Имбирь — это превосходная трава или специя, которая существует уже тысячи лет.

Это популярный и эффективный лекарственный ингредиент в Аюрведе. Имбирь часто называют корнем, подземным стеблем, известным как корневище.

Благодаря своему сильному и пряному аромату имбирь занимает важное место как пряность, деликатес и даже лекарство.

Используется не только в свежем виде, но и после сушки, в порошкообразном или маринованном виде, а также в виде сока и масла.

Говорят, что имбирь ускоряет рост волос.

ПОДРОБНЕЕ: Лечение выпадения волос — добавка для ускорения роста волос

Как имбирь может помочь при выпадении волос?

Имбирь улучшает кровообращение в коже головы, что приводит к притоку крови к ней.

Он также стимулирует волосяные фолликулы и способствует их росту.

Жирные кислоты имбиря полезны для тонких волос.

Человек может сделать маску для волос, натерев одну столовую ложку корня имбиря в небольшой миске и добавив в нее одну столовую ложку масла жожоба.

Рекомендуется вотрите эту пасту в кожу головы круговыми движениями и оставьте примерно на 30 минут или дольше.

Затем смойте шампунем.

Различные способы использования имбиря для увеличения роста волос

Имбирное масло

Имбирное масло выпускается в виде экстрактов или эфирных масел, последнее из которых необходимо разбавить маслом-носителем перед нанесением. Нанесите продукт на кожу головы и волосы, чтобы получить пряный, бодрящий аромат.

Смойте через 15–30 минут.

Имбирный сок

Имбирный сок производится непосредственно из корня имбиря. Вы можете отрезать край свежего корня и массировать его прямо на кожу головы.

Другой метод — измельчить корень в блендере и нанести на все волосы.

Маска для волос с имбирем

Чтобы сделать маску с имбирем для волос, вы можете использовать имбирный сок, эфирное масло или экстракт в сочетании с равными частями масла-носителя, такого как аргановое, кокосовое или жожоба.